目的:特发性肺纤维化急性加重是特发性肺纤维化病情发展的特殊、危重阶段,是该病死亡的最常见原因,具有病情进展迅速、发病率逐年升高、死亡率高等特点。目前国内外关于该病的研究基础相对薄弱,对该病的发病机制、治疗方法尚无统一共识,临床仅以缓解症状、纠正低氧血症为目的的支持性护理以及糖皮质激素作为主要治疗手段,且疗效仍存在巨大争议;此外,在动物实验基础方面,尚无统一动物模型建立方法,一定程度上大大限制了实验研究的深度和广度。因此,本实验研究以上述现状为出发点,基于肺络病指导理论,结合导师多年临证经验,提出特发性肺纤维化急性加重期“肺热络瘀”的病机内涵,并在肺络构效理论指导下,拟“清热解毒、养阴通络”之中药复方“清络饮”,基于具有易行性、重现性、经济性的模型建立方法,验证该复方治疗效果并采用多方法、多靶点探讨不同时相中药复方干预Th1/Th2细胞因子失衡、MMPs/TIMPs失衡效果,从而全面揭示其抗肺纤维化急性加重的作用机理。本研究旨在为该病动物实验研究发展奠定模型基础、用科学的方法揭示中医药在该病治疗方面的独特优势、为未来新药创制提供第一手研究资料。材料与方法:1、大鼠肺间质纤维化急性加重模型建立1.1采用前后两次气管内注射博来霉素的方法诱导特发性肺纤维化急性加重模型;1.2将120只SPF级雄性Wistar大鼠采用随机数字表法随机分成三组,每组40只,即AE-IPF组、IPF组以及Control组,适应性饲养3天后进行第一次博来霉素造模,于首次造模后第28天进行二次博来霉素造模。根据肺纤维化动态病理演变规律,设定7d、14d、31d、35d、42d五个时间点进行取材和指标观察;1.3观察不同时相各组大鼠一般生存状态、干湿重比、肺系数、肺组织形态学指标(肉眼外观、HE染色及肺泡炎病理评分、Masson染色及纤维化病理评分);1.4观察31d、35d、42d各组大鼠动脉血氧分压;1.5检测不同时相各组大鼠肺组织内羟脯氨酸含量;1.6采用免疫组化方法检测不同时相各组大鼠肺组织内α-SMA蛋白表达水平2、探讨中药复方清络饮对博来霉素诱导大鼠IPF各分期的作用及机制2.1采用前后两次气管内注射博来霉素的方法复制特发性肺纤维化急性加重模型;2.2将240只SPF级雄性Wistar大鼠采用随机数字表法随机分成六组,每组40只,即Control组、AE-IPF组、Low-dose组、Middle-dose组、High-dose组、GCS(激素)组。设定7d、14d、28d、31d四个时间点进行取材和指标观察;2.3观察各组大鼠各时相一般生存状态、干湿重比、肺系数、肺组织形态学指标(肉眼外观、HE染色及肺泡炎病理评分、Masson染色及纤维化病理评分);2.4观察28d、31d各组大鼠动脉血氧分压、计算各组血氧分压在31d时平均下降率;2.5检测各组大鼠各时相肺组织内羟脯氨酸含量;2.6采用western-blot、免疫组化、Quantitative Real-time PCR方法检测各组大鼠各时相对肺组织α-SMA表达的情况;2.7多种方法观察各时相各组大鼠Th1/Th2细胞因子失衡状态:采用ELISA、western-blot、免疫组化、Quantitative Real-time PCR方法,分别从含量、蛋白表达、m RNA表达三个层次检测各时相各组大鼠IL-12、IL-4、IFN-γ水平,并探讨IL-12与IL-4/IFN-γ比值相关性,证实IL-12具有调节IL-4/IFN-γ的比值,调整细胞因子失衡状态的作用,阐明清络饮干预Th1/Th2细胞因子失衡的作用机制;2.8多种方法观察各时相各组大鼠MMP-9/TIMP-1失衡状态:采用western-blot、免疫组化、Quantitative Real-time PCR方法,分别从多层次检测各时相各组大鼠MMP-9、TIMP-1蛋白和m RNA表达情况,阐明清络饮干预MMP-9/TIMP-1失衡、加速ECM降解的作用机制。结果:1、大鼠肺间质纤维化急性加重模型建立1.1一般状态:二次造模前,IPF组与AE-IPF组大鼠一般状态无差异,较同期Control组更差;二次造模后,与IPF组相比AE-IPF组大鼠出现明显喘息气促、呼吸困难、抓鼻紫绀状态,且体重呈持续下降趋势、死亡率显著增加;1.2肺湿干重量比、肺系数:二次造模后AE-IPF组W/D、肺系数与IPF、Control组相比出现显著增高,即出现明显的急性肺水肿表现;1.3肺组织形态学:AE-IPF组大鼠7d时肺组织呈现肺泡炎改变为主、14d以成纤维细胞增生为主、31d以后表现为弥漫性肺泡损伤、大量炎性浸润、肺透明膜形成、大量胶原纤维沉着、成纤维细胞灶活跃,与Control组和IPF组相比分别在一次造模和二次造模后出现显著差异;1.4动脉血氧分压:与其他两组比较,AE-IPF组31d时Pa O2出现最低水平,随后在35d、42d出现增高趋势,42d时AE-IPF组动脉血氧分压与IPF组相比无显著差异;1.5组织内羟脯氨酸含量:AE-IPF组大鼠肺组织内羟脯氨酸含量在实验过程中持续增加,二次造模后三个时间点含量均显著高于同期IPF组;1.6α-SMA免疫组化:实验全程Control组大鼠肺组织α-SMA仅在较大血管、支气管壁的平滑肌细胞胞浆中呈现弱阳性表达;IPF组自7d开始α-SMA表达水平持续缓慢增高;AE-IPF组二次造模前与同期IPF组阳性表达强度无显著差异,但在二次造模后仍持续出现阳性表达增强,阳性表达强度显著高于同期IPF组。2、探讨中药复方清络饮对肺间质纤维化急性加重大鼠的作用及机制2.1成功复制肺间质纤维化急性加重模型;2.2一般状态、肺湿干重量比、肺系数:中药复方清络饮能够明显改善各时间点大鼠一般状态和体重下降趋势、降低死亡率、减轻急性肺水肿,从整体上对一般功能状态损伤有一定改善作用,其中中剂量组效果最佳,部分指标改善方面优于西药组;2.3肺组织形态学:中药复方清络饮能够在病理组织形态学方面能够有效减轻肺间质纤维化急性加重期急性弥漫性肺泡炎程度、改善中晚期及急性加重期肺内细胞外基质沉积、抑制活跃的成纤维细胞灶形成,其中中剂量组效果最佳,在改善纤维化程度方面略优于西药组;2.4动脉血氧分压:中药复方清络饮能够明显减轻大鼠机体低动脉血氧分压状态,改善急性加重期大鼠缺氧状态,31d各实验组中中剂量组动脉血氧分压与28d相比下降率最低,效果最佳。2.5组织内羟脯氨酸含量:中药复方清络饮能够有效降低肺纤维化各个阶段(尤其是急性加重期)组织内羟脯氨酸含量,减少胶原蛋白合成,减轻细胞外基质沉积,各实验剂量比较中剂量组效果最佳。2.6α-SMA蛋白和mRNA表达:中药复方清络饮能够减少肺组织α-SMA蛋白表达水平和m RNA表达水平、抑制Fb向MFb转化、阻断成纤维细胞灶生成过程、延缓IPF病理过程,中剂量组效果最佳。2.7 Th1/Th2细胞因子:与空白组相比,模型组出现了显著Th2优势现象,即IL-4表达水平增高、IL-12和IFN-γ表达水平降低。中药复方清络饮能够减少大鼠血清中IL-4含量,增加IFN-γ和IL-12含量;下调肺组织中IL-4蛋白和IL-4m RNA表达水平,上调IFN-γ和IL-12蛋白和m RNA表达水平,纠正Th2漂移状态,恢复Th1/Th2细胞因子平衡,延缓肺纤维化病理进程,中剂量组效果最佳且略优于西药组。2.8 MMP-9/TIMP-1:与空白组相比,模型组大鼠肺组织中MMP-9m RNA/TIMP-1m RNA数值随肺纤维化病程进展呈现“早期增大-中晚期减小-急性加重期增大”的表现,且MMP-9、TIMP-1蛋白和m RNA表达水平在各个时间点均有不同程度上调,其中TIMP-1表达呈持续增高状态,而MMP-9表达水平在7d时显著增高、14d-28d出现短暂下降、28d再次增高。中药复方清络饮能够下调各个时间点肺组织中MMP-9和TIMP-1蛋白和m RNA表达水平,使MMP-9m RNA/TIMP-1m RNA持续趋向平衡,进而减轻肺泡基底膜损伤、促进胶原降解、抗肺纤维化,各中药剂量中中剂量组效果最佳,且在下调急性加重期TIMP-1蛋白表达水平方面明显优于西药组。结论:1、采用博来霉素先后两次(0d,5mg/kg;28d,7mg/kg)气管内注射方法可成功诱导大鼠肺间质纤维化急性加重模型;各观察时间点相比较,31d时模型大鼠临床表现、病理变化与人类特发性肺间质纤维化急性加重表现最为接近,可以将其作为急性发作模型观察的关键时间点。2、中药复方清络饮能够有效改善AE-IPF大鼠喘息、咳嗽、体重下降等一般状态,改善缺氧状态,减轻肺泡炎症、减少胶原合成和细胞外基质沉积,从而改善大鼠AE-IPF程度。3、中药复方清络饮可抑制Th2代表性细胞因子----IL-4表达,促进Th1代表性细胞因子---IFN-γ表达,促进Th1/Th2关键维稳细胞因子---IL-12表达,改善Th1/Th2细胞因子失衡状态,延缓肺纤维化进展,减轻急性加重病理状态。4、IL-12在维持Th1/Th2细胞因子平衡方面存在重要作用。5、中药复方清络饮可通过抑制MMP-9、TIMP-1表达,促进MMP-9/TIMP-1动态平衡,延缓肺纤维化进展,减轻急性加重病理状态。6、理论研究认为络病理论指导下AE-IPF基本病机为“肺热络瘀”,其中“肺热”主要包括痰热、毒热、阴虚肺热;“络瘀”主要包括气闭络瘀、气虚络瘀、痰凝血瘀、毒损络瘀、瘀热互结。