论文部分内容阅读
水产动物疾病对水产养殖业发展构成了重大威胁。鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus,SVCV）是引起水产动物疾病重要的病原体,是一种急性的、感染率高的传染病,造成多种鲤科鱼类疾病暴发。SVCV是一种RNA病毒,由磷蛋白P、核蛋白N、糖蛋白G、基质蛋白M和依赖病毒RNA的RNA聚合酶L这5种结构蛋白组成,在病毒的生命周期中发挥着不同的作用。病毒感染引起的先天免疫系统是宿主防御病原体感染的关键防线。因此,对于其致病机制及与宿主免疫之间关系仍有待进一步研究。1斑马鱼SETD3抑制SVCV复制SETD3（the actin histidine methyltransferase SET domain containing 3）是一种甲基转移酶,包括保守的SET结构域和rubis-sub-bind（RSB）结构域,是PKMT家族的成员。SETD3的失调可对各种疾病的发生和进展产生不利影响,包括癌症。但是关于SETD3蛋白与病毒的相关研究则屈指可数。在本研究中证明了斑马鱼SETD3能够抑制SVCV的复制。Setd3在胚胎的发育阶段都有表达并且呈现上调的趋势,在组织中呈组成型表达。Setd3在感染SVCV后的鳃、脾脏、肾脏、肝脏组织中,其表达均有所上调但不显著。为了检测Poly（I:C）或SVCV刺激下ZF4细胞中setd3的表达情况。Poly（I:C）刺激ZF4细胞或用SVCV感染ZF4细胞12 h、24 h、48 h。结果显示,Poly（I:C）刺激12 h后,setd3 m RNA水平略有升高,在刺激24 h后检测到显著性升高。ifnφ1、isg15和mx1（两个典型的IFN刺激基因）的表达也上调。相反,SVCV感染导致setd3在12 h和48 h的表达下降。与Poly（I:C）刺激的效果相似,SVCV感染后也诱导了ifnφ1、isg15和mx1。这些结果表明SVCV已有效感染至ZF4细胞中。进而在ZF4和EPC细胞中过表达SETD3后感染SVCV,其中SVCV n和SVCV g m RNA的转录水平以及释放到培养基中的病毒与对照组细胞相比,都受到了明显的抑制作用。与过表达全长SETD3相似,过表达缺失SET和RSB结构域质粒同样对SVCV n和SVCV g m RNA水平产生抑制作用。2 SETD3与SVCV病毒蛋白的功能研究鉴于SETD3抑制SVCV病毒复制,我们假设SETD3可能参与病毒蛋白的翻译后修饰。为了验证SETD3与SVCV病毒蛋白的关系,HEK293细胞共转染SETD3质粒和表达病毒蛋白质粒,包括SVCV G,SVCV N,SVCV P,SVCV M或者SVCV L。结果表明SETD3可以与SVCV五个病毒蛋白相互作用,其中SETD3与SVCV P和SVCV L展现出相对更高的亲和力。接下来我们检测SETD3是否通过SVCV P和L蛋白的降解抑制病毒复制。结果显示过表达SETD3可使SVCV P和L蛋白水平呈剂量依赖性降低。通过共聚焦显微镜检测显示,SETD3和SVCV P主要分布在细胞质中,并在细胞质中共定位。SVCV感染或Poly（I:C）刺激均未改变其细胞质位置。接着我们通过细胞核和细胞质分离实验发现SETD3和SVCV P蛋白水平大部分聚集在细胞质中。与共聚焦显微镜观察一致,Poly（I:C）刺激或SVCV感染并未导致细胞质或细胞核中这两种蛋白水平的任何改变。通过三个降解途径的抑制剂来探究SETD3降解SVCV P的降解途径,结果显示SETD3通过蛋白酶途径降解SVCV P。通过进一步的实验发现,SETD3过表达可显著诱导SVCV P的K48多聚泛素化,从而证明SETD3可催化SVCV P的K48多聚泛素化-蛋白酶体降解,来抑制SVCV复制。本研究首次表明SETD3介导的SVCV P蛋白降解可能会改善病毒逃逸的情况,有助于有效的免疫应答。3斑马鱼PLAAT1组织表达及功能研究PLAAT1属于PLAATs蛋白家族,有报道称其调节细胞生长,参与肿瘤抑制和磷脂代谢。然而,PLAAT1是否参与p53介导的信号转导尚未研究。我们报道PLAAT1在斑马鱼中促进p53的降解。我们发现plaat1基因在肝脏、肾脏、脾脏、肠道、眼睛和大脑等组织中呈组成型表达,其中在大脑和眼睛中均有较高的表达水平。Plaat1过表达可抑制p53和tnfα的表达。研究进一步发现PLAAT1与p53相互作用,通过自噬溶酶体依赖途径促进其降解。4斑马鱼PLAAT1降解IRF3和IRF7来抑制干扰素的产生PLAAT1最初被发现是一种肿瘤抑制因子,命名为A-C1。最近,PLAAT1已被证明对线粒体、内质网和溶酶体等细胞器的降解至关重要。然而,斑马鱼PLAAT1在先天免疫应答中的调控作用,特别是在IFN信号通路中的免疫应答作用仍不清楚。在本研究中我们发现斑马鱼PLAAT1是被Poly（I:C）或SVCV所诱导,为了探讨PLAAT1是否对病毒的复制与增殖有抑制作用,在EPC细胞中过表达plaat1后感染SVCV,结果显示plaat1的过表达提高了SVCV n和SVCV g m RNA表达水平,因此导致SVCV复制水平上调。另外,还使用了空斑测定法对收集得到的细胞培养基上清液中感染性病毒颗粒进行了检测分析,与对照组相比,plaat1过表达组细胞培养基上清处理的细胞,与对照组相比空斑数量增多。这些数据表明,过表达plaat1促进了病毒复制。利用双荧光报告实验证明过表达plaat1可显著抑制poly（I:C）和SVCV诱导IFNφ1和ISRE的启动子活性。此外,PLAAT1可抑制rig-1、irf3和irf7所诱导的IFNφ1和ISRE的启动子活性。进一步CO-IP试验证明,PLAAT1与IRF3和IRF7相互作用。接下来我们检测PLAAT1是否通过IRF3和IRF7的降解抑制IFN信号通路。结果显示PLAAT1与IRF3和IRF7相互作用并结合IRF3和IRF7的IAD结构域。接下来我们检测PLAAT1是否通过IRF3和IRF7的降解干扰素产生。结果显示过表达PLAAT1可使IRF3和IRF7蛋白水平呈剂量依赖性降低。通过三个降解途径的抑制剂来探究PLAAT1降解IRF3和IRF7的降解途径,结果显示PLAAT1通过自噬体途径降解IRF3和IRF7来抑制IFN表达,从而促进病毒的复制。本研究报道了斑马鱼PLAAT1在调节细胞抗病毒反应中的新作用。