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第一部分,介绍由“公共引物”介导的多重PCR技术的应用研究。
目的:建立由“公共引物”介导的PCR反应体系及条件以期进一步用于多重PCR体系的建立。
方法:以噬菌体基因组为参考序列设计“公共引物”序列,并以人类基因组为模板检测“公共引物”结合“嵌合引物”的特异性及灵敏性。
结果:“公共引物”具有高特异性、高敏感性的特点,“公共引物”结合“嵌合引物”PCR反应体系可大幅降低“嵌合引物”浓度。
结论:由“公共引物”介导的PCR反应体系可大幅降低引物间相互作用概率,为多重PCR体系的建立奠定基础。
第二部分,突变敏感性“分子开关”检测p53、HBB基因热点突变。
目的:利用突变敏感性“分子开关”技术建立对p53、HBB基因热点突变的检测体系。
方法:利用PCR及基因克隆技术得到p53、HBB基因野生及突变模板质粒。设计硫化修饰引物,利用突变敏感性“分子开关”技术对突变位点进行检测。
结果:当硫化修饰检测引物与突变模板配对时,反应得以进行,有PCR产物;与野生模板不配对时,反应非成熟性终止,无PCR产物。
结论:突变敏感性“分子开关”技术能够快速检测p53、HBB基因突变位点,达到非此即彼的二元化效果。
第三部分,TALENs蛋白酶在艾滋病基因治疗应用的前期研究。
目的:构建具有剪切CCR5基因的TALENs腺病毒包装载体,并建立相应的蛋白酶活性检测系统。
方法:利用PCR技术结合限制性内切酶将目的基因片段定向克隆至载体中,结合绿色荧光蛋白检测重组TALENs蛋白酶活性。
结果: TALENs蛋白酶已定向克隆至载体中,细胞转染结果表明重组TALENs蛋白酶具有较高的酶切效率。
结论:成功构建TALENs腺病毒包装载体,并建立相应蛋白酶活性检测体系。