论文部分内容阅读
铅是广泛分布于生态环境中的一种重金属，对机体的损伤呈多系统和多器官性。肾脏是铅毒性作用的重要靶器官，近端小管是铅致肾损伤的靶部位。前期研究证实，钙离子稳态失衡诱导细胞凋亡在铅暴露的原代大鼠肾小管上皮细胞毒性损伤中发挥着重要的作用。内质网作为细胞内重要的钙库，在胞内钙稳态调控中发挥主要作用；细胞内钙稳态失衡介导内质网应激从而诱发细胞凋亡。Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）是一个重要的细胞内钙离子信号调控者，具有调控内质网应激性凋亡途径的作用；但CaMKII对肾小管上皮细胞内钙离子的调控机制尚不清楚；CaMKII对肾小管上皮细胞内质网应激以及凋亡的详细机制也有待研究。因此，本研究在原代大鼠肾小管上皮细胞培养过程中进行铅染毒，重点探讨CaMKII在胞内钙稳态失衡中的作用，以及钙稳态失衡与内质网应激在细胞凋亡中的内在联系。 首先，为了探究铅对肾小管上皮细胞中内质网应激的影响，采用免疫印迹技术检测铅染毒对内质网应激标志蛋白(GRP78, GRP94, CRT, CHOP, caspase-12)表达水平的变化。结果表明，铅可导致肾小管上皮细胞内质网应激；同时激活内质网应激介导的细胞凋亡。 其次，在铅染毒过程中，使用三种Ca2+调控剂(2-APB, TG, BAPTA-AM)处理肾小管上皮细胞，采用流式细胞术检测 [Ca2+]c和[Ca2+]ER的水平，结果发现三种Ca2+调控剂可有效的调节[Ca2+]c和[Ca2+]ER的水平。我们通过免疫印迹技术分析[Ca2+]c和[Ca2+]ER处理下内质网应激标志蛋白的表达水平。结果表明，铅染毒的肾小管上皮细胞中钙稳态失衡诱发内质网应激。 第三，通过免疫印迹技术检测铅染毒后CaMKII (t-CaMKII, p-CaMKII) 蛋白水平的变化趋势；结果发现铅导致肾小管上皮细胞中CaMKII活化。 最后，用CaMKII的两种抑制剂(KN-93, KN62)处理肾小管上皮细胞，通过免疫印迹技术检测内质网应激性细胞凋亡，通过流式细胞术及形态学观察检测细胞凋亡率，采用激光共聚焦显微技术分别检测[Ca2+]c和[Ca2+]ER的变化。结果发现， CaMKII 抑制剂KN-93和KN-62抑制肾小管上皮细胞中CaMKII磷酸化水平的同时，也减缓了铅导致的内质网应激性细胞凋亡。同样，细胞凋亡率的检测也表明CaMKII抑制剂KN93或KN62可以有效地抑制铅诱导的肾小管上皮细胞凋亡。此外，KN93或KN62的处理显著的缓解了肾小管上皮细胞中铅诱导的内质网钙离子释放和胞浆中钙离子超载。 综上所述，低浓度铅处理的肾小管上皮细胞中，活化的CaMKII通过调控细胞内钙离子分布，从而诱发内质网应激介导的细胞凋亡的详细机制。本项研究为重金属铅积蓄所致肾毒性治疗的基础研究提供了依据。