金龙胆草(Conyza blinii H. Lev.)是一种菊科白酒草属植物,主要呈野生状态,分布于四川攀西地区、云南中南部及贵州部分地区。其活性成分在慢性支气管炎、胃溃疡等疾病的治疗上具有良好疗效。多年来,金龙胆草的研究集中在化学成分种类和主要活性成分药理药效等方面,对其有效成分含量的研究却鲜见报道,基于分子生物学层面的研究更属于空白领域。本研究广泛收集了金龙胆草资源在主产区攀西地区的分布信息,对采集的样品利用ICP-AES手段进行了无机元素含量检测,利用紫外分光光度法进行了总黄酮和总皂苷含量的检测,利用高效液相色谱法进行了芦丁、槲皮素和苦蒿素含量的检测；通过RAPD、SRAP和SCAR分子标记对该区域内野生金龙胆草居群间的遗传多样性进行了研究；利用RACE技术克隆了金龙胆草黄酮代谢途径的关键酶查尔酮合酶基因和三萜皂苷代谢途径的关键酶p-香树酯合酶基因。主要结果如下：1.以攀西地区野生金龙胆草生长环境为背景,研究了金龙胆草的生长环境和植物形态,发现金龙胆草在不同的生长时期植物形态变化较大。比较了野生和人工栽培植株叶片的超显微结构,扫描电镜结果显示,除人工栽培品种的叶片上偶可观察到圆形气孔外,两类叶片的腺毛、非腺毛、表皮等的显微差别并不大。2.无机元素的含量检测结果显示,5个不同来源的金龙胆草均不含重金属Cr和Cd,而Fe/Mn含量均较高,除Al元素显示出凉山州样品明显较多外,其它元素在样品间的含量较为相似。对16个不同来源的金龙胆草进行了总黄酮和总皂苷含量的检测,总黄酮含量较高,在4.660%-7.530%之间；对花期植株花、叶、茎、根四个组织部位的黄酮成分芦丁、槲皮素进行了测定,发现芦丁和槲皮素含量均为叶中最高,含量分别占总黄酮成分的0.478%和0.158%。三萜总皂苷的含量在0.566%～0.909%之间,且以叶中最高；二萜成分苦蒿素的含量在0.560%～1.185%之间,以叶中含量最高。抗氧化实验显示金龙胆草粗提物及分离纯化的总皂苷对DPPH自由基和羟自由基均有较好的抑制作用。以总黄酮、总皂苷和苦蒿素含量为指标,将攀西16个来源的金龙胆草聚为四大类,聚类的结果显示有效成分含量的相似性并不完全与其所处地理位置的远近相关,说明野生金龙胆草次生代谢物的产生不仅与地理位置有关,还可能与纵向海拔等生长地的小物候环境有关。3.利用RAPD和SRAP分子标记技术对16个不同来源地金龙胆草进行了遗传多样性研究,15条RAPD引物和12对SRAP引物分别获得140个和318个多态位点,平均相似系数分别为0.6732和0.6804。合并的RAPD-SRAP标记结合了两种标记的特点,得到平均遗传相似性为0.6787,数据显示金龙胆草在攀西地区遗传多样性并不丰富,这可能与该植物生长地较集中,区域内能进行基因交流的国土面积不大有关。RAPD-SRAP标记将16个不同来源样品聚为三类,聚类结果与地理位置十分相关,来自攀枝花市的样品和凉山州的8、9样被聚为Ⅰ类,凉山的10和11样被聚为Ⅱ类,其余凉山州的样品聚为第Ⅲ类,显示了攀西地区野生金龙胆草居群间的亲缘关系与地理分布较高的关系。RAPD转化的SCAR标记研究结果显示,金龙胆草SCAR标记为共显性标记,16个样品的SCAR特异片段同源性较高(71.32%)。利用该标记能快速明确地将金龙胆草与其易混淆植物艾草、木里白酒草和黄花蒿区分开来。着重研究了黄花蒿与金龙胆草的特异鉴别,结果显示,理想状态下黄花蒿药材中仅含有5%金龙胆草时,SCAR标记便能快速灵敏地鉴别出金龙胆草的踪影。4.本研究利用RACE技术从金龙胆草中克隆得到黄酮途径关键酶查尔酮合酶基因和三萜皂苷合成途径β-香树酯合酶基因,分别命名为CbCHS和CbβAS:CbCUS (GenBank登录号KJ155749)包含有一个长为1197bp的开放阅读框,编码的蛋白序列与其它植物有高度的同源性,在第63位半胱氨酸密码子内第1位和第2位碱基之间、第294位甘氨酸密码子内第1位和第2位碱基之间分别含有1个415bp的内含子和1个486bp大小的内含子,这与植物查尔酮合酶家族普遍含有1个内含子情况的有所不同。CbCRS编码的蛋白具有查尔酮合酶家族的特征多肽序列GVLFGFGPGL,和必需的活性位点Cys (C) 167、His (H) 306和Asn (N) 339;半定量RT-PCR分析结果显示金龙胆草花期CbCHS表达量为茎>叶>花>根。表达量与有效成分含量相关性分析显示花器官中CHS的表达量与花青素相对含量,芦丁、槲皮素含量有极显著的正相关关系,r值均趋于1。构建原核表达载体pET-CbCHS进行原核表达分析,SDS-PAGE检测结果显示诱导得到了43.5kD左右的融合蛋白,表明CbCHS基因在E.coli BL21中成功表达。5.Cbβ3AS (GenBank登录号KJ650043)包含有一个长为2151bp的开放阅读框,全长cDNA序列比对显示其编码的氨基酸与其它植物的pAS基因具有较高的同源性,序列包含该基因家族特有的DCTAE保守序列和QW保守序列。半定量RT-PCR分析结果显示金龙胆草花期CbβAS的表达量为叶>茎>花>根,各个部位的三萜总皂苷含量检测结果为叶>花>根>茎。相关性分析显示CbβAS表达量与根部皂苷含量正相关,说明上调该基因表达量使其在根部实现皂苷含量的增加的可能性较高。