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本研究采用程序冷冻、直接冷冻、玻璃化冷冻和开放式拉管法(OPS)法对小鼠桑葚胚和早期囊胚进行了冷冻保存,探讨了不同冷冻方法对胚胎存活率的影响,并从冷冻保护剂、植冰温度等不同角度加以研究,以胚胎冷冻后的体外培养和移植来鉴定其冷冻效果。 结果表明:1.将6~8周龄的昆明种雌鼠15只随机分为三组,分别用PMSG和HCG以不同的处理剂量(5IU,10IU,15IU)进行超排处理,每只平均获得胚胎数分别为16.2、23.2和19.0枚,正常胚数分别为12.6、18.8和13.4枚,正常胚的比率分别为:77.78%、81.03%和70.53%,均达到了超排效果。结果表明10IU的处理剂量的超排效果较好(p>0.05)。2.将超排获得的桑葚胚和早期囊胚随机分为(1)20%乙二醇(EG)+20%DMSO处理30秒,再经0.3M蔗糖处理1 min;(2)20%甘油(Gly)+20%1,2—丙二醇(1,2-Pro)处理30秒,再经0.3M蔗糖(Suc)处理1min;(3)经0.3M蔗糖处理(解冻液处理组)1 min;(4)不经任何冷冻液和解冻液处理(对照组)四组。分别24h培养表明:扩张囊胚率为91.23%、80.65%、89.58%和90.74%;48h后的孵化率为64.91%、51.61%、83.33%和85.19%。(1)和(2)组间差异不显著,二者与(3)和(4)相比,差异均显著(p<0.01)。3.分别用F1、F2和F3三种冷冻保护剂,行常规程序冷冻方法冷冻,解冻后培养结果表明:扩张囊胚率分别为78.18%、73.58%和57.14%;孵化囊胚率为45.45%、41.51%和26.53%,F1和F2显著高于F3(p<0.05)。4.将获得的桑葚胚和早期囊胚放入冷冻液F1中平衡5min,冷冻室内停留2min后植冰,再行程序冷冻。证明:-5.5℃、-6.0℃、-6.5℃植冰时,胚胎解冻后体外囊胚孵化率分别为40.38%、45.45%、12.50%,-5.5℃和-6.0℃组的显著高于-6.5℃组(p<0.01)。5.分别用程序冷冻、常规玻璃化冷冻、OPS、直接冷冻法对小鼠桑葚胚进行冷冻保存。解冻后存活率分别为78.18%、70.37%、81.36%和44.92%;48h后的孵化率分别为45.45%、44.44%、50.85%和27.54%。前三种方法组间差异不显著,但直接冷冻法和其他各组相比差异极显著(p<0.01)。6.将上述四种方法冷冻保存的83、68、75和71枚胚胎解冻后分别移植给8、6、6和6只受体,平均每只10~13枚,结果表明:妊娠率为12.5%(1/8)、16.67%(1/6)、16.67%(1/6)和16.67%(1/6)。