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目的:大量流行病学调查研究发现约20%恶性肿瘤与慢性感染因素相关,细菌作为潜在的致癌因素,细菌感染与宿主细胞之间的相互作用成为肿瘤分子机制研究的热点。上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞失去其上皮性特征而获得间质样改变的过程,细胞间连接减弱,肌动蛋白骨架重塑使得细胞迁移和侵袭能力增加。在肿瘤发生发展过程中,上皮间充质转化发挥重要作用,细菌可能通过诱导上皮间充质转化促进肿瘤发生引起广泛关注。口腔细菌与肿瘤,尤其是口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的发生发展一直是学者们研究的热点。研究发现,与正常组织相比,在OSCC组织中具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)的检出量更高,提示F.nucleatum可能参与调控口腔肿瘤的发生发展过程。F.nucleatum是一种重要的牙周可疑致病菌,参与牙周疾病的炎症反应,同时还与多种口腔外疾病相关,如早产低体重儿,呼吸道疾病,结直肠肿瘤等。目前,F.nuleatum感染与肿瘤相关性的研究大多聚焦在F.nucleatum对结直肠肿瘤发生发展的影响,且已提出多种可能的分子作用机制。F.nucleatum可通过诱导炎症和免疫应答形成肿瘤微环境,促进结肠癌肿瘤进展。F.nucleatum菌体表面的粘附素FadA可与结肠癌细胞表面的E-cadherin结合,进而激活?-catenin信号通路,促进肿瘤细胞生长。F.nucleatum感染与口腔上皮细胞恶性转化及是否可促进口腔上皮细胞发生上皮间充质转化的报道较少,且作用机制尚不明确。因此,基于以上研究背景,本实验对F.nucleatum在口腔鳞癌组织和正常组织中的存在情况进行了验证,并试图通过建立F.nucleatum感染口腔上皮细胞模型,探究F.nucleatum对口腔上皮细胞上皮间充质转化的作用及可能涉及的分子机制。研究方法:1.收集口腔鳞癌患者手术切除癌组织和阻生齿拔除患者的正常牙龈组织,应用荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)方法检测口腔鳞癌组织和正常对照组织中的F.nucleatum,以验证F.nucleatum在口腔鳞癌组织和正常组织中的不同富集情况。2.建立F.nucleatum模式株ATCC25586和戈登链球菌(Streptococcus gordonii)Challis CH1菌株单独感染HIOECs和SCC-9细胞的体外模型,CCK-8实验检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡改变,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,明胶酶谱实验检测细胞上清液中MMP-2和MMP-9的表达。3.采用免疫荧光染色方法观察F.nucleatum感染HIOECs和SCC-9细胞后上皮间充质转化标志分子E-钙粘蛋白(E-cadherin),N-钙粘蛋白(N-cadherin),波形蛋白(Vimentin)和转录因子SNAI1的蛋白表达情况,及F.nucleatum感染后2 h-12 h E-cadherin的表达及定位改变。分别利用qRT-PCR和Western blot检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和SNAI1 mRNA和蛋白水平变化。热灭活F.nucleatum和纯化的FadA蛋白分别处理HIOECs和SCC-9细胞,qRT-PCR检测SNAI1等上皮间充质转化标志分子的mRNA表达。4.高通量测序技术分析F.nucleatum感染HIOECs后差异表达的lncRNA和mRNA,针对上皮间充质转化相关的部分基因进行聚类分析和KEGG信号通路分析,并利用qRT-PCR对筛选出的差异表达基因进行验证。5.采用siRNA干扰技术抑制MIR4435-2HG表达,细胞转染24 h后加入F.nucleatum继续感染24 h或48 h,qRT-PCR和Western blot检测SNAI1的mRNA和蛋白表达变化。通过在线数据库预测可与MIR4435-2HG和SNAI1结合的miRNAs及其相应的结合位点,qRT-PCR检测筛选出的miRNAs表达水平。单独转染MIR4435-2HG si RNA敲低MIR4435-2HG表达及共转染MIR4435-2HG siRNA和miR-296-5p inhibitor,利用qRT-PCR及Western blot检测miR-296-5p和SNAI1的mRNA和蛋白表达水平。采用双荧光素酶报告基因实验验证MIR4435-2HG与miR-296-5p及miR-296-5p与SNAI1的结合情况。6.qRT-PCR检测F.nucleatum感染HIOECs和SCC-9细胞后及共转染MIR4435-2HG siRNAs和miR-296-5p inhibitor后Akt2的m RNA表达,Western blot检测分别转染MIR4435-2HG siRNAs和miR-296-5p inhibitor后Akt2的蛋白表达;采用siRNA干扰技术抑制Akt2表达并检测SNAI1 mRNA和蛋白表达水平改变。结果:1.与正常对照组织相比,F.nucleatum在口腔鳞癌组织中富集程度更为显著,提示F.nucleatum感染与口腔鳞癌的发生发展存在一定的相关性。2.与未感染的对照细胞相比,F.nucleatum感染HIOECs和SCC-9对细胞增殖无显著影响,而S.gordonii感染对细胞增殖能力略有抑制;流式细胞仪检测发现F.nucleatum感染不能加速细胞周期进程,但F.nucleatum感染后细胞凋亡率增加;细胞划痕实验检测发现,F.nucleatum感染能够显著促进细胞迁移,而S.gordonii感染对细胞迁移能力无显著影响;明胶酶谱实验发现F.nucleatum感染能够促进细胞MMP-9活性增加。3.F.nucleatum感染HIOECs和SCC-9后,Vimentin、N-cadherin及SNAI1的mRNA和蛋白表达均增加,而E-cadherin的mRNA和蛋白表达减少;免疫荧光染色结果发现,在未感染的对照细胞中,E-cadherin主要分布在细胞膜上,细胞之间连接紧密,而F.nucleatum感染后,E-cadherin在细胞膜上的表达减少,且可在细胞质内观察到E-cadherin的分布;qRT-PCR结果显示,热灭活F.nucleatum和FadA蛋白均能引起HIOECs和SCC-9细胞SNAI1等上皮间充质转化标志分子mRNA异常表达。4.高通量测序结果分析显示,F.nucleatum感染HIOECs细胞引起的差异表达基因中(变化倍数≧4,P<0.05,FDR<0.05),共有164个lncRNA差异表达(74个lncRNA表达上调,90个lncRNA表达下调),887个mRNA表达上调和1866个mRNA表达下调。在差异表达基因中,涉及多个与上皮间充质转化相关的分子,KEGG分析显示这些分子主要富集在粘附连接信号通路。5.F.nucleatum感染HIOECs和SCC-9细胞能够上调MIR4435-2HG表达,转染siRNA抑制MIR4435-2HG表达后,SNAI1的mRNA和蛋白表达均下降;而在敲低MIR4435-2HG表达后继续感染F.nucleatum则能够在一定程度上回复SNAI1的表达。在线数据库预测及qRT-PCR验证发现,miR-296-5p与MIR4435-2HG及SNAI1存在潜在结合位点,且F.nucleatum感染能够显著下调miR-296-5p的表达;抑制MIR4435-2HG表达后可上调miR-296-5p表达,而转染miR-296-5p inhibitor可上调SNAI1的表达。双荧光素酶报告基因实验证实MIR4435-2HG能够与miR-296-5p结合,而miR-296-5p与SNAI1无结合。6.F.nucleatum感染能够促进Akt2的表达,敲低MIR4435-2HG表达后Akt2mRNA和蛋白表达均受到抑制,而转染miR-296-5p inhibitor后Akt2 mRNA和蛋白表达增加,而通过siRNA干扰技术敲低Akt2可抑制SNAI1 mRNA和蛋白表达。结论:1.F.nucleatum在口腔鳞癌组织中富集,提示F.nucleatum感染可能与OSCC相关。2.F.nucleatum感染对HIOECs和SCC-9细胞增殖及细胞周期进程无显著影响,但促进了细胞凋亡发生并使细胞迁移能力增加。3.F.nucleatum感染HIOECs和SCC-9细胞可增加N-cadherin、Vimentin及SNAI1表达,引起E-cadherin表达减少及功能丧失,始动和促进非肿瘤性和肿瘤性口腔上皮细胞发生上皮间充质转化改变,且热灭活F.nucleatum和FadA具有与F.nucleatum活菌相似的促进上皮间充质转化的作用。4.F.nucleatum感染可通过lncRNA MIR4435-2HG/mi R-296-5p/Akt2/SNAI1信号通路促进口腔上皮细胞发生上皮间充质转化。