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前言：
宫颈癌是全世界妇女中第二位常见的恶性肿瘤,在中国女性中发病率居第一位。宫颈癌的形成是一个渐进的变化过程,一般要经过鳞状上皮不典型增生、原位癌发展到浸润癌。目前高危型HPV持续感染被公认是宫颈病变进展为宫颈癌的高危因素。但是HPV感染不是导致宫颈癌的唯一因素。提示有其他辅助因素共同参与宫颈癌发病病理机制。因此,近年来促进宫颈癌发生发展的分子基础研究受到广泛关注。蛋白水解酶降解细胞外基质是肿瘤生长和转移的关键步骤。组织因子途径抑制物-2(Tissuefactorpathwayinhibitor2,TFPI-2),又称胎盘蛋白-5(placentalprotein5,PP5)和基质相关丝氨酸蛋白酶抑制剂(matrixassociatedserineproteaseinhibitor,MSPI),是一种相对分子质量为32-kDa的广谱的库尼(Kunitz)型丝氨酸蛋白酶抑制剂,可由人体内多种组织合成分泌相应的细胞外基质(ECM)中。研究发现TFPI-2能够抑制ECM相关的胰蛋白酶,纤溶酶,凝血因子Ⅶ(FVlla)/组织因子(tissuefactor,TF)复合物等从而维持ECM结构的完整性。
人类TFPI-2基因定位于染色体7q22,与组织因子途径抑制物(Tissuefactorpathwayinhibitor,TFPI)相似,TFPI-2分子共包含3个Kunitz结构域。TFPI-2对蛋白水解酶的抑制作用,主要是通过Kunitz结构域1对丝氨酸蛋白水解酶活性的抑制。参与ECM降解的一系列蛋白酶中,最关键的是基质金属蛋白酶(MMPs)。MMPs几乎参与了ECM重塑的所有过程。上调MMPs的表达能够明显促进包括宫颈癌在内的大多数恶性肿瘤的发生发展。而TFPI-2可以通过多价螯合作用抑制MMPs酶原激活,从而有效调节MMPs的活性。TFPI-2基因存在一个典型的220bp的磷酸胞苷酰(cytidylylphosphateguano-sine,CpG)岛区域。目前研究发现,在许多类型的人类肿瘤细胞中,都发现编码TFPI-2基因的抑制及缺失。TFPI-2的表达抑制与其启动子区域的超甲基化状态有关。TFPI-2作为一种丝氨酸蛋白酶抑制物,具有抑制肿瘤侵袭、转移的功能。
研究发现TFPI-2在宫颈癌组织及宫颈癌细胞株中存在高甲基化状态,但是目前关于TFPI-2对宫颈癌发生发展的关系以及对肿瘤细胞生物学行为的影响尚未见报道。本课题旨在研究TFPI-2在宫颈癌组织中的表达作用情况,比较其与宫颈癌临床病理特征的关系;TFPI-2的表达在体内与体外对宫颈癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响,为寻找宫颈癌治疗提供新思路。
方法：
一、TFPI-2在宫颈癌组织中的表达及与宫颈癌临床病理参数的关系
应用免疫组化方法检测68例宫颈癌、48例CIN和12例正常宫颈组织中TFPI-2蛋白的表达,并探讨其与宫颈癌临床期别、病理分级及淋巴结转移等临床病理参数之间的关系。
二、通过体外实验研究TFPI-2对宫颈癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响
免疫组织化学方法检测宫颈癌组织中Ki-67,VEGF,CD34的表达;TUNEL法检测细胞凋亡,计算凋亡指数;建立TFPI-2高表达细胞系;Westernblot和Real-timePCR方法检测基因转染前后细胞中TFPI-2蛋白和mRNA的表达;MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞仪技术检测细胞周期;AnnexinⅤ/FITC检测细胞凋亡;Transwell检测细胞侵袭能力。
三、TFPI-2对人宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤生长的影响
TFPI-2转染前后的宫颈癌细胞系裸鼠移植瘤的建立;观察裸鼠的一般情况,每四天测量肿瘤的体积,处死裸鼠后测量肿瘤的体积和重量;Real-timePCR和免疫组化检测转染前后移植瘤TFPI-2基因和蛋白表达水平。
结果：
一、TFPI-2在宫颈癌组织中表达
正常宫颈组织、CIN和宫颈癌中TFPI-2表达逐渐降低,三者间比较差异有统计学意义(P＜0.001)。宫颈癌组织中FFPI-2表达水平与宫颈癌的FIGO分期及淋巴结转移有关(P＜0.05)。但是与宫颈癌的分化程度及病理类型之间无明显统计学意义。
二、TFPI-2对宫颈癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响
(1)在宫颈癌组织中,TFPI-2阴性组凋亡指数(AI)明显低于TFPI-2阳性组(P=0.001);VEGF和MVD在TFPI-2阴性组中的表达高于TFPI-2阳性组(P＜0.05);
(2)TFPI-2阳性组中AI在正常宫颈组织、CIN和宫颈癌组织中逐渐增加,差异有统计学意义(P＜0.001);CINⅡ/Ⅲ和宫颈癌中PI明显高于正常宫颈上皮(P＜0.05);宫颈癌中VEGF和MVD表达明显高于CIN组织和正常宫颈上皮组织(P＜0.001);
(3)TFPI-2在宫颈癌中的表达与AI呈正相关(P=0.004):相反,TFPI-2的表达与VEGF和MVD呈负相关(P＜0.001);但是与PI之间的关系无明显统计学意义;
(4)pcDNA3.1-TFPI2转染HeLA细胞后TTPI-2mRNA和蛋白表达明显高于对照组;
(5)MTT结果显示HeLa-TFPI-2组细胞增殖速度受到抑制,且随着培养时间的延长,这种抑制更明显(P＜0.05);
(6)AnnexinV/PI结果显示HeLa-TFPI-2组细胞凋亡率显著高于空白对照组和空质粒对照组细胞,差异有统计学意义;
(7)流式细胞仪分析细胞周期结果显示与对照组相比,HeLa-TFPI-2组细胞的周期,G1期增加,S期减少;
(8)细胞侵袭实验结果显示HeLa-TFPI-2组的穿膜细胞数明显低于空白对照组和空质粒对照组。
三、TFPI-2抑制人宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤生长的研究
(1)三组裸鼠一般情况无差异性变化;(2)在接种第4、8、12天测量肿瘤的肿瘤体积,结果显示HeLa-TFPI-2组肿瘤的体积低于其他两组对照组,且各组之间的生长曲线的差异有统计学意义;(3)裸鼠处死后取出肿瘤称重,各组间肿瘤重量差异具有统计学意义:(4)HeLa-TFPI-2组肿瘤细胞中TFPI-2mRNA的表达情况明显高于其他两个对照组,TFPI-2mRNA及蛋白表达情况一致。
结论：
一、TFPI-2表达随着宫颈病变的进展逐渐降低。提示TFPI-2的表达减少可能是宫颈癌发生发展的机制之一。TFPI-2阳性表达率与宫颈癌的FIGO分期及淋巴结转移相关,提示TFPI-2表达下调与宫颈癌的不良预后相关。
二、TFPI-2通过抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,抑制细胞周期进展及抑制肿瘤血管生成等多重作用来影响宫颈癌细胞的增殖和生长。TFPI-2能显著抑制宫颈癌细胞的侵袭能力。
三、动物体内实验证实了TFPI-2能明显抑制HeLa细胞裸鼠移植瘤的生长,在宫颈癌发生发展中发挥重要的作用,可能成为治疗宫颈癌的新靶点。为进一步研究宫颈癌的发生发展提供了新的思路。