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跨损伤DNA合成(Translesion DNA Synthesis，TLS)是一种DNA损伤耐受机制，它利用一类特殊的DNA聚合酶直接以损伤DNA为模板整合核苷酸进行DNA复制，避免基因组发生双链断裂以及细胞死亡。Y家族DNA聚合酶是细胞中最主要的TLS聚合酶，在哺乳动物细胞中该家族成员主要包括聚合酶Polη、Pol、Polκ和REV1。其中，Polη能够正确复制紫外线(Ultraviolet，UV)和顺铂(cisplatin，CDDP)诱发的DNA损伤，该特性使得Polη与皮肤癌的发生和多种肿瘤药物的耐药性密切相关。然而，目前关于Polη的功能调控机制，特别是蛋白质翻译后修饰如何调控其功能所知甚少。 在本研究中，利用免疫共沉淀和质谱分析技术发现Polη和O-连接-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)存在相互作用，其O-GlcNAc糖基化修饰主要发生在Polη442-471肽段上。紫外辐射处理后，Polη的O-GlcNAc糖基化修饰水平显著升高，暗示着Polη的O-GlcNAc糖基化修饰很可能在UV诱导产生的跨损伤合成通路中发挥功能。利用基因定点诱变技术，突变了该肽段上的几个潜在的O-GlcNAc糖基化位点，构建了Polη的O-GlcNAc糖基化修饰突变体5A(T457A/S458A/S459A/S466A/T471A)。抑制Polη的O-GlcNAc糖基化修饰虽然不影响其到UV诱发损伤位点的招募和跨过环丁烷嘧啶二聚体(Cyclobutane Pyrimidine，CPD)损伤的聚合酶活性，但是阻碍了CRLCDT2E3连接酶复合物催化的Polη多泛素化修饰，导致在TLS完成后Polη不能被p97识别进而不能从复制叉处正常解离，引起UV诱发的细胞突变率升高。此外，O-GlcNAc糖基化修饰位点突变还导致Polη在CDDP诱发产生的损伤位点处TLS能力降低，引起CDDP诱发的卵巢癌干细胞富集比例下降。因此，Polη的O-GlcNAc糖基化修饰为进一步研究体内TLS调控和化疗药物耐药性奠定了基础。 已知TLS过程与基因组突变的产生密切相关，穿梭质粒pSP189诱变检测系统是一种传统的检测细胞内突变率的方法。目前二代测序技术极大推动了生物学和生物医学相关研究进展，但仍无法检测细胞内DNA损伤诱发的低频突变。在本论文研究中，结合穿梭质粒pSP189诱变检测系统，开发了一种超灵敏二代测序平台“EasyMF”，能够快速检测跨损伤合成聚合酶在损伤诱发突变中发挥的功能。 新开发的突变分析平台“EasyMF”起始步骤与传统pSP189突变率分析实验操作相似，包括损伤处理质粒并将其转染HEK293T细胞进行复制等，但它省去了后续的质粒转化大肠杆菌MBM7070、蓝白斑筛选和测序鉴定等步骤，能够灵敏地检测到TLS聚合酶缺陷的HEK293T细胞中UV损伤处理后质粒的突变率。该方法不仅可以快速获得全面足量的测序结果，而且经济适用，为筛选调控TLS通路的新蛋白因子和监测环境中的毒性试剂提供便利，促进对基因组稳定性和突变产生的机制研究。