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目的：检测非小细胞肺癌患者循环血中外泌体内miRNA的表达种类及表达量，查找并分析差异性表达的miRNA与患者自身临床病理特征及预后的关系。
方法：选取2017年到2019年四川省肿瘤医院首诊非手术治疗的17例非小细胞肺癌患者，主要采用放射治疗的治疗手段，并分治疗前和治疗中两次采集患者静脉血样，用SeraMir?外泌体RNA扩增试剂盒提取血浆中外泌体并扩增外泌体内的RNA，构建RNA的cDNA文库和qPCR定量后进行高通量测序，筛选测序结果，鉴定出miRNA，使用RNA-seq分析软件分析，miRNA表达量用TPM进行表达量归一化处理。将患者分别按病理分期、肿瘤体积消退率大小、免疫组织化学检查结果等临床病理特征进行分组比对，同时比对治疗前和治疗中的样本，查找表达差异有统计学意义的miRNA，分析各种差异表达的miRNA的表型特征与患者临床病理特征的相关性。
结果：17例患者中的5例抽取了治疗前和治疗中两次血液样本，将这22个血浆样本根据患者的病理分期、肿瘤体积消退率（TRG）等临床病例特征，分组分析患者循环血Exo-miRNA的差异表达情况。
1.研究对象的基本情况
17例患者的男女比为12:5，年龄范围在48~77岁之间，平均年龄为62.2岁，病理分期为Ⅰ期的1例，Ⅲ期的6例，Ⅳ期的10例，9例患者行单纯放疗（RT），6例行放化疗结合（CRT），2例靶向治疗（TRT），经治疗TRG小于等于30%的（1组）6例，TRG介于30%~50%的（2组）7例，TRG大于等于50%的（3组）4例，RESIST评分部分缓解（PR）的10例，疾病稳定（SD）的4例，疾病进展（PD）的3例。22个血浆样本中治疗前的13个，其中同源样本5个，非同源样本8个，治疗中的样本9个，同源5个，非同源4个；鳞癌样本12个，腺癌样本9个，低分化癌样本1个；Ⅰ期样本2个，Ⅲ期样本5个，Ⅳ期样本15个。
2.治疗前差异表达的miRNA情况
治疗前，Ⅰ期较Ⅲ期显著上调的有miR-451a（|log2FoldChange|=3.284，P=2.88E-11）等32种miRNA，下调的有miR-146a-5p（|log2FoldChange|=1.347，P=0.005）等23种miRNA，Ⅰ期较Ⅳ期上调的有miR-432-5p（|log2FoldChange|=1.8289，P=0.0009）等27种miRNA，下调的有miR-146a-3p（|log2FoldChange|=1.6122，P=0.005）等14种，Ⅲ期较Ⅳ期显著上调的有miR-3161（|log2FoldChange|=1.8751，P=0.001757）等4种miRNA，下调的有miR-451a（|log2FoldChange|=1.9331，P=0.000424）等8种miRNA，其中，miR-490-3p在三个病理分期中共同差异表达，表现为Ⅲ期较Ⅳ期高表达，|log2FoldChange|=1.497，P=0.016308，Ⅲ期较Ⅰ期高表达|log2FoldChange|=1.507，P=0.027，Ⅳ期较Ⅰ期高表达|log2FoldChange|=1.48，P=0.035；miR-3161也表现为Ⅲ期较Ⅳ期上调（|log2FoldChange|=1.8751，P=0.001757），Ⅲ期较Ⅰ期上调（|log2FoldChange|=1.591，P=0.021）。各个病理分期患者的转归表现为Ⅰ期患者100%PR；Ⅲ期患者40%PR，40%SD，20%PD；Ⅳ期患者67%PR，20%SD，13%PD。
治疗前TRG1组血样较2组血样miR-92a-3p（|log2FoldChange|=1.1854，P=0.004421）等12种miRNA上调，miR-210-3p（|log2FoldChange|=1.2791，P=0.002504）等12种miRNA下调，1组血样较3组血样上调的有miR-34c-5p（|log2FoldChange|=1.5064，P=0.022304）等6种miRNA，下调的有miR-96-5p（|log2FoldChange|=1.6069，P=0.007731）等5种miRNA，其中miR-92a-3p表现为1组表达高于2组和3组。本组患者中，1组的有25%转归达到PR，75%为SD；2组有83%达到PR，3组的有67%达到PR。
治疗前TTF-1阳性患者血样（5个）较TTF-1阴性患者血样（3个）的miR-206（|log2FoldChange|=1.5719,P=0.011722）等4种miRNA表达均上调，而miR-372-5p（|log2FoldChange|=1.5697,P=0.005833）等3种miRNA的表达下调。
3.治疗过程中表达发生变化的miRNA情况
比对治疗前和治疗中的血样，3种miRNA在同源和非同源血浆中均表现为治疗中表达量下降，miR-3174在同源血浆和非同源血浆中的差异度相似，|log2FoldChange|均为1.3左右，P＜0.01，miR-451b和miR-375-3p在非同源血浆中的差异度较同源血浆更高，分别为同源血浆的|log2FoldChange|=1.0778,P=0.03825、|log2FoldChange|=1.0361,P=0.045695和非同源血浆的|log2FoldChange|=1.1488,P=0.022709、|log2FoldChange|=1.1415,P=0.018463。治疗前血样的患者经治疗后TRG≤30%的占比为30.8%，TRG＞30%的占比为69.2%，在后期的RESIST评分中，达PD的人数占比为7.7%；而治疗中血样的患者经治疗后TRG≤30%的占比为44.4%，TRG＞30%的占比为55.5%，在RESIST评分中，达PD的人数占比为22.2%。
在TRG的各个分组中，部分miRNA在治疗前组间无显著差异，治疗中出现差异表达。在1组和2组的比较中，1组表达更高的是miR-11400，|log2FoldChange|=1.7506，P=0.003513；1组表达更低的有miR-19a-3p（|log2FoldChange|=1.2402,P=0.012602）、miR-19b-3p（|log2FoldChange|=1.1459,P=0.020787）、miR-142-3p（|log2FoldChange|=1.0652,P=0.023799），1组比3组上调的有miR-206（|log2FoldChange|=2.8866,P=1.83E-05），下调的有miR-19a-3p（|log2FoldChange|=2.1949,P=0.000607）、miR-19b-3p（|log2FoldChange|=2.2572,P=0.000132）、miR-142-3p（|log2FoldChange|=1.9986,P=0.000419）。
TTF-1阴性血样在治疗中比治疗前下调的有miR-197-5p、miR-148a-3p、miR-511-5p。
结论：1.在本实验中NSCLC患者的miR-92a-3p、miR-19、miR-142-3p的高表达与患者的治疗肿瘤消退体积正相关；miR-3174、miR-375、miR-451过表达与肿瘤消退体积正相关，且提示预后更好。
2.在本实验中NSCLC患者的miR-3161和miR-490-3p高表达与预后负相关，miR-34c-5p在NSCLC中的表达量与肿瘤消退体积负相关。
3.在本实验中NSCLC患者的miR-206在肺腺癌中的表达与TTF-1的表达密切相关；miR-11400首次被发现在Ⅰ期患者中表达高于Ⅲ期患者，且在TRG小于等于30%的患者中表达量高于TRG大于30%的患者。
本文借临床NSCLC患者的循环血Exo-miRNA的差异表达定量分析，从临床角度验证了部分miRNA在NSCLC细胞实验中的结果，同时结合患者临床特征查找到Exo-miRNA的表型特征，有利于对一些研究较少的miRNA作进一步实验研究。
方法：选取2017年到2019年四川省肿瘤医院首诊非手术治疗的17例非小细胞肺癌患者，主要采用放射治疗的治疗手段，并分治疗前和治疗中两次采集患者静脉血样，用SeraMir?外泌体RNA扩增试剂盒提取血浆中外泌体并扩增外泌体内的RNA，构建RNA的cDNA文库和qPCR定量后进行高通量测序，筛选测序结果，鉴定出miRNA，使用RNA-seq分析软件分析，miRNA表达量用TPM进行表达量归一化处理。将患者分别按病理分期、肿瘤体积消退率大小、免疫组织化学检查结果等临床病理特征进行分组比对，同时比对治疗前和治疗中的样本，查找表达差异有统计学意义的miRNA，分析各种差异表达的miRNA的表型特征与患者临床病理特征的相关性。
结果：17例患者中的5例抽取了治疗前和治疗中两次血液样本，将这22个血浆样本根据患者的病理分期、肿瘤体积消退率（TRG）等临床病例特征，分组分析患者循环血Exo-miRNA的差异表达情况。
1.研究对象的基本情况
17例患者的男女比为12:5，年龄范围在48~77岁之间，平均年龄为62.2岁，病理分期为Ⅰ期的1例，Ⅲ期的6例，Ⅳ期的10例，9例患者行单纯放疗（RT），6例行放化疗结合（CRT），2例靶向治疗（TRT），经治疗TRG小于等于30%的（1组）6例，TRG介于30%~50%的（2组）7例，TRG大于等于50%的（3组）4例，RESIST评分部分缓解（PR）的10例，疾病稳定（SD）的4例，疾病进展（PD）的3例。22个血浆样本中治疗前的13个，其中同源样本5个，非同源样本8个，治疗中的样本9个，同源5个，非同源4个；鳞癌样本12个，腺癌样本9个，低分化癌样本1个；Ⅰ期样本2个，Ⅲ期样本5个，Ⅳ期样本15个。
2.治疗前差异表达的miRNA情况
治疗前，Ⅰ期较Ⅲ期显著上调的有miR-451a（|log2FoldChange|=3.284，P=2.88E-11）等32种miRNA，下调的有miR-146a-5p（|log2FoldChange|=1.347，P=0.005）等23种miRNA，Ⅰ期较Ⅳ期上调的有miR-432-5p（|log2FoldChange|=1.8289，P=0.0009）等27种miRNA，下调的有miR-146a-3p（|log2FoldChange|=1.6122，P=0.005）等14种，Ⅲ期较Ⅳ期显著上调的有miR-3161（|log2FoldChange|=1.8751，P=0.001757）等4种miRNA，下调的有miR-451a（|log2FoldChange|=1.9331，P=0.000424）等8种miRNA，其中，miR-490-3p在三个病理分期中共同差异表达，表现为Ⅲ期较Ⅳ期高表达，|log2FoldChange|=1.497，P=0.016308，Ⅲ期较Ⅰ期高表达|log2FoldChange|=1.507，P=0.027，Ⅳ期较Ⅰ期高表达|log2FoldChange|=1.48，P=0.035；miR-3161也表现为Ⅲ期较Ⅳ期上调（|log2FoldChange|=1.8751，P=0.001757），Ⅲ期较Ⅰ期上调（|log2FoldChange|=1.591，P=0.021）。各个病理分期患者的转归表现为Ⅰ期患者100%PR；Ⅲ期患者40%PR，40%SD，20%PD；Ⅳ期患者67%PR，20%SD，13%PD。
治疗前TRG1组血样较2组血样miR-92a-3p（|log2FoldChange|=1.1854，P=0.004421）等12种miRNA上调，miR-210-3p（|log2FoldChange|=1.2791，P=0.002504）等12种miRNA下调，1组血样较3组血样上调的有miR-34c-5p（|log2FoldChange|=1.5064，P=0.022304）等6种miRNA，下调的有miR-96-5p（|log2FoldChange|=1.6069，P=0.007731）等5种miRNA，其中miR-92a-3p表现为1组表达高于2组和3组。本组患者中，1组的有25%转归达到PR，75%为SD；2组有83%达到PR，3组的有67%达到PR。
治疗前TTF-1阳性患者血样（5个）较TTF-1阴性患者血样（3个）的miR-206（|log2FoldChange|=1.5719,P=0.011722）等4种miRNA表达均上调，而miR-372-5p（|log2FoldChange|=1.5697,P=0.005833）等3种miRNA的表达下调。
3.治疗过程中表达发生变化的miRNA情况
比对治疗前和治疗中的血样，3种miRNA在同源和非同源血浆中均表现为治疗中表达量下降，miR-3174在同源血浆和非同源血浆中的差异度相似，|log2FoldChange|均为1.3左右，P＜0.01，miR-451b和miR-375-3p在非同源血浆中的差异度较同源血浆更高，分别为同源血浆的|log2FoldChange|=1.0778,P=0.03825、|log2FoldChange|=1.0361,P=0.045695和非同源血浆的|log2FoldChange|=1.1488,P=0.022709、|log2FoldChange|=1.1415,P=0.018463。治疗前血样的患者经治疗后TRG≤30%的占比为30.8%，TRG＞30%的占比为69.2%，在后期的RESIST评分中，达PD的人数占比为7.7%；而治疗中血样的患者经治疗后TRG≤30%的占比为44.4%，TRG＞30%的占比为55.5%，在RESIST评分中，达PD的人数占比为22.2%。
在TRG的各个分组中，部分miRNA在治疗前组间无显著差异，治疗中出现差异表达。在1组和2组的比较中，1组表达更高的是miR-11400，|log2FoldChange|=1.7506，P=0.003513；1组表达更低的有miR-19a-3p（|log2FoldChange|=1.2402,P=0.012602）、miR-19b-3p（|log2FoldChange|=1.1459,P=0.020787）、miR-142-3p（|log2FoldChange|=1.0652,P=0.023799），1组比3组上调的有miR-206（|log2FoldChange|=2.8866,P=1.83E-05），下调的有miR-19a-3p（|log2FoldChange|=2.1949,P=0.000607）、miR-19b-3p（|log2FoldChange|=2.2572,P=0.000132）、miR-142-3p（|log2FoldChange|=1.9986,P=0.000419）。
TTF-1阴性血样在治疗中比治疗前下调的有miR-197-5p、miR-148a-3p、miR-511-5p。
结论：1.在本实验中NSCLC患者的miR-92a-3p、miR-19、miR-142-3p的高表达与患者的治疗肿瘤消退体积正相关；miR-3174、miR-375、miR-451过表达与肿瘤消退体积正相关，且提示预后更好。
2.在本实验中NSCLC患者的miR-3161和miR-490-3p高表达与预后负相关，miR-34c-5p在NSCLC中的表达量与肿瘤消退体积负相关。
3.在本实验中NSCLC患者的miR-206在肺腺癌中的表达与TTF-1的表达密切相关；miR-11400首次被发现在Ⅰ期患者中表达高于Ⅲ期患者，且在TRG小于等于30%的患者中表达量高于TRG大于30%的患者。
本文借临床NSCLC患者的循环血Exo-miRNA的差异表达定量分析，从临床角度验证了部分miRNA在NSCLC细胞实验中的结果，同时结合患者临床特征查找到Exo-miRNA的表型特征，有利于对一些研究较少的miRNA作进一步实验研究。