论文部分内容阅读
胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,化疗作为胃癌术后最有效的辅助治疗手段之一,在防治胃癌的复发与转移方面的作用举足轻重。奥沙利铂(Oxaliplatin, L-OHP)是继顺铂和卡铂之后的第三代铂类抗癌药,已逐渐成为治疗进展期胃癌的主要药物,并显示出良好的应用前景,但部分胃癌患者仍表现出对铂类化疗药物耐药。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)被认为是诱发肿瘤浸润和转移的早期关键事件,而近几年的研究发现肿瘤细胞中EMT的发生与肿瘤细胞的耐药性有密切关系。一种观点认为已发生EMT的肿瘤细胞对化疗药物敏感性降低。另一种观点认为当肿瘤细胞通过逐渐诱导的方法建立耐药细胞株往往会发生EMT；而逆转EMT,能够增加耐药细胞株对药物的敏感性。这种由于肿瘤细胞发生EMT而获得的耐药性,成为后期治疗的难题,因此研究肿瘤细胞EMT发生与耐药的关系对于肿瘤治疗具有重要的现实意义。我们前期关于EphA2在胃癌侵袭转移和耐药机制方面的研究发现,将pEGFP-N1-CMV-EphA2慢病毒过表达载体转染入胃癌SGC-7901细胞后,EphA2过表达的胃癌细胞获得间质样表型,侵袭能力更强,EMT核转录因子Snail、间质细胞标记物N-cadherin和Wnt/β-catenin通路相关因子β-catenin、TCF-4、cyclinD1蛋白水平上调,而上皮细胞标记物E-cadherin蛋白水平下降,提示EphA2可能通过Wnt/β-catenin通路调控胃癌细胞EMT的发生。我们发现EphA2过表达组胃癌细胞对不同浓度的奥沙利铂敏感性均降低,说明EphA2在胃癌细胞奥沙利铂耐药过程中可能发挥重要作用。为进一步揭示EphA2在胃癌细胞EMT发生和耐药中的作用,本研究建立人胃癌奥沙利铂耐药细胞株SGC-7901/L-OHP,研究其细胞生物学特点以及靶向沉默EphA2在SGC-7901/L-OHP细胞中的表达能否逆转其EMT发生从而影响其对奥沙利铂的敏感性。目的：初步探讨EphA2与胃癌奥沙利铂耐药细胞EMT关系。方法：人胃癌SGC-7901细胞在1640培养液中,37℃、5%的Co2饱和湿度下培养,用0.25%的胰蛋白酶消化传代；采用逐步递增浓度间歇诱导法建立人胃癌奥沙利铂耐药细胞株SGC-7901/L-OHP;应用倒置相差显微镜观察耐药细胞株的形态学改变：通过细胞计数法绘制细胞生长曲线,根据公式：Td(h)=T×[log2/(logN-logN0)],计算耐药细胞系的倍增时间；应用噻唑蓝(MTT)比色法测定耐药细胞株对奥沙利铂的敏感性及耐药指数；采用实时荧光定量RT-PCR和Western-blot方法测定耐药细胞株与亲代细胞株中的EphA2表达；并采用RNA干扰技术靶向沉默EphA2在胃癌奥沙利铂耐药细胞中的表达,qRT-PCR和Western blot检测EMT相关因子上皮细胞标记物E-cadherin,间质细胞标记物N-cadherin和核转录因子Snail的表达水平,MTT法检测沉默EphA2对胃癌奥沙利铂耐药细胞L-OHP敏感性变化。结果1.历时6个月建成人胃癌奥沙利铂耐药细胞株SGC-7901/L-OHP。 SGC-7901/L-OHP细胞呈梭形贴壁生长,细胞变为长条形与梭形,边缘伸出长角,细胞间连接较松散,获得了间质样表型；绘制细胞生长曲线发现SGC-7901/L-OHP细胞的群体倍增时间为27.44+2.01h,与胃癌SGC-7901细胞相比,增殖速度减慢,群体倍增时间延长约3h(P<0.05)。随浓度增高,L-OHP对胃癌SGC-7901细胞以及SGC-7901/L-OHP细胞的抑制作用逐渐增强,同一浓度L-OHP对SGC-7901/L-OHP细胞的抑制率明显低于胃癌SGC-7901细胞(P<0.05),胃癌奥沙利铂耐药SGC-7901/L-OHP细胞对L-OHP的耐药指数为9.7,并且经反复传代、冻存、复苏后,复测其耐药指数仍保持不变。2.与胃癌SGC-7901细胞比较,SGC-7901/L-OHP细胞中EphA2mRNA和蛋白的表达明显上调(P<0.05)。3.EphA2siRNA能明显抑制SGC-7901/L-OHP细胞中EphA2mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。4.沉默SGC.7901/L-OHP细胞中EphA2的表达,能够显著上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达(P<0.05),并下调N-cadherin和Snail mRNA和蛋白的表达(P<0.05),并且增加SGC-7901/L-OHP细胞对L-OHP的敏感性(P<0.05)。结论1.利用浓度梯度递增法诱导建立的人胃癌奥沙利铂耐药细胞株SGC-7901/L-OHP,具有稳定的耐药性,可为体外肿瘤细胞耐药研究提供良好的实验模型。2.人胃癌奥沙利铂耐药细胞株SGC-7901/L-OHP中EphA2呈过表达,并且EphA2参与了胃癌细胞在耐药形成过程中EMT的发生。3.EphA2siRNA能够抑制胃癌奥沙利铂耐药SGC-7901/L-OHP细胞EMT。并提示EphA2可能通过影响EMT参与了胃癌奥沙利铂耐药细胞对L-OHP的敏感性。