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目的循环中游离线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是脓毒症后免疫抑制的关键分子,巨噬细胞mtDNA是循环中游离mtDNA的主要来源之一,本研究拟探讨程序性坏死在巨噬细胞释放mtDNA中的作用。方法用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)构建小鼠巨噬细胞mtDNA释放的细胞模型。分别应用凋亡抑制剂z-VAD、RIPK1特异性抑制剂Nec-1、RIPK3特异性抑制剂GSK’872处理细胞1h后,然后LPS处理24h。观察LPS处理巨噬细胞后mtDNA、核DNA释放情况的分组为:Control组(灭菌水)、1μg/ml LPS组;观察LPS处理巨噬细胞后程序性坏死发生情况的分组为:Control组(DMSO)、z-VAD组、Nec-1组、GSK’872组、1μg/ml LPS组、z-VAD+1μg/ml LPS组、Nec-1+1μg/ml LPS组、GSK’872+1μg/ml LPS组;观察程序性坏死在mtDNA释放中的作用的分组为:Control组(DMSO)、Nec-1组、GSK’872组、Nec-1+1μg/ml LPS组、GSK’872+1μg/ml LPS组。透射电镜观察各处理组细胞形态;实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测胞外、胞浆、胞内DNA水平;乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测胞外LDH分泌量;流式细胞技术观察凋亡发生率。结果1.1μg/ml LPS处理巨噬细胞24h后,胞外、胞浆线粒体基因DLOOP/COX I释放量增加(P<0.05),胞外核基因18S释放量增加(P<0.05),胞内线粒体基因D-LOOP/COX I拷贝数增加(P<0.05),核基因18S拷贝数变化不明显(P>0.05)。2.1μg/ml LPS处理巨噬细胞24h后,胞外、胞浆线粒体基因DLOOP/COX I分泌量比核基因18S分泌量高(P<0.05)。3.1μg/ml LPS处理巨噬细胞24h后,电镜发现细胞膜完整性受损,未见凋亡小体;与对照组比较,胞外LDH含量增加(P<0.05)。4.25μM z-VAD预处理巨噬细胞1h后,1μg/ml LPS处理巨噬细胞24h,与1μg/ml LPS处理巨噬细胞24h组比较,电镜下细胞坏死情况没有明显差异,流式细胞技术测总凋亡率没有统计学差异(P>0.05)。RIPK1特异性抑制剂Nec-1预处理巨噬细胞1h后,1μg/ml LPS处理巨噬细胞24h,与1μg/ml LPS处理巨噬细胞24h组比较,胞外LDH分泌量降低(P<0.05);RIPK3特异性抑制剂GSK’872预处理巨噬细胞1h后,1μg/ml LPS处理巨噬细胞24h,与1μg/ml LPS处理巨噬细胞24h组比较,胞外LDH分泌量没有统计学差异(P>0.05)。5.RIPK1特异性抑制剂Nec-1预处理巨噬细胞1h后,1μg/ml LPS处理巨噬细胞24h,与1μg/ml LPS处理巨噬细胞24h组比较,胞外mtDNA、核DNA释放量降低(P<0.05);胞浆mtDNA释放量增加(P<0.05)、核DNA释放量没有统计学差异(P>0.05);胞内mtDNA、核DNA拷贝数没有统计学差异(P>0.05)。RIPK3特异性抑制剂GSK’872预处理巨噬细胞1h后,然后1μg/ml LPS处理24h,与1μg/ml LPS处理巨噬细胞24h组比较,胞外mtDNA、核DNA释放量,胞浆mtDNA、核DNA释放量,胞内mtDNA、核DNA拷贝数没有统计学差异(P>0.05)。结论1.LPS促进巨噬细胞线粒体基因释放到胞浆、胞外,促进核基因释放到胞外。2.LPS处理巨噬细胞后,线粒体基因比核基因更容易释放到胞浆、胞外,说明线粒体基因比核基因对应激损伤更加敏感。3.LPS促进线粒体基因拷贝数增加,说明在应激状态下,细胞能量代谢增强,线粒体功能活跃,线粒体DNA合成增多。4.LPS处理巨噬细胞后在不需要抑制凋亡的情况下,可能通过RIPK1介导程序性坏死。5.程序性坏死可能促进巨噬细胞mtDNA、核DNA释放到胞浆、胞外,对核DNA释放到胞浆影响不明显。综上所述:LPS处理巨噬细胞后,可能通过RIPK1介导的程序性坏死促进mtDNA释放。