论文部分内容阅读
在肉用动物生产中,脂肪组织的沉积和分布与肉牛生产效率及经济效益关系密切。其中肌内脂肪含量是影响牛肉品质的关键因素,对牛肉多汁性、嫩度和风味等肉品质具有重要影响,提高肌内脂肪含量是改善牛肉品质的重要途径。ZBTB16基因在动物个体发育、胚胎发生、染色体重构和细胞周期调控等方面发挥着重要的作用。本研究旨在探讨ZBTB16基因对牛肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响,为通过分子育种手段调控脂质沉积奠定理论基础。试验共分为以下四个部分:第一部分:本研究旨在建立西门塔尔杂交牛肌内前体脂肪细胞的体外培养体系。采集成年西门塔尔杂交牛背最长肌处肌肉组织,分离肌内脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶分离获得前体脂肪细胞,进行前体脂肪细胞的原代和传代培养,并对其进行生长曲线的测定、细胞形态观察、油红O染色鉴定及脂肪含量的测定,且采用实时荧光定量RT-qPCR检测脂肪细胞分化关键基因PPARγ、C/EBPα、FABP4、ATGL、ADIOQ、HSL及LPL的mRNA在牛肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达。结果显示,分离的原代前体脂肪细胞约6h开始贴壁,细胞贴壁良好,细胞形态多为小梭形或形状不一的三角形,传代后杂质减少,细胞成分单一,第5～11天细胞进入指数生长期,细胞生长曲线近似“细胞形;诱导培养第8天细胞充脂率高,油红O染色呈红色,细胞内脂肪含量显著高于未诱导组(P<0.05),具有前体脂肪细胞的典型特征。PPARγ、C/EBPα、FABP4、ADIPOQ和ATGL的表达量随着分化过程增强(P<0.05),HSL的表达量随着分化过程逐渐降低(P<0.05),而LPL的表达量在细胞分化早期逐渐升高,分化后期逐渐下降(P<0.05)。本研究成功建立了牛肌内前体脂肪细胞的体外培养方法和诱导分化方法,揭示了分化关键基因在此过程中的表达规律,为进一步研究肉牛肌内脂肪沉积和改善肉品质奠定基础。第二部分:本研究旨在研究ZBTB16基因过表达对牛肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响。对牛肌内前体脂肪细胞进行腺病毒载体Ad-ZBTB16(ZBTB16过表达载体)和Ad-GFP(腺病毒空载体)转染,细胞培养24h后,进行荧光拍照并观察细胞形态。结果显示,利用病毒载体(感染复数280)转染细胞后,细胞形态正常,呈纺锤状成纤维细胞样,贴壁牢固,荧光观察转染率在90%以上。RT-qPCR检测病毒转染后第1天的Ad-ZBTB16过表达效率,结果显示,Ad-ZBTB16组ZBTB16的mRNA极显著高于空白对照组和Ad-GFP组(P<0.01),约为空白对照组的30倍;Western Blot检测转染后第2天细胞内ZBTB16蛋白表达量,结果显示,Ad-ZBTB16组ZBTB16蛋白水平极显著高于空白对照组和Ad-GFP组(P<0.01),表明ZBTB16基因在牛肌内前体脂肪细胞中成功过表达。使用CCK-8测定细胞增殖活性,结果显示,与空白对照组和Ad-GFP组相比,Ad-ZBTB16组并无显著差异(P>0.05),表明ZBTB16对牛肌内前体脂肪细胞的增殖并无显著影响。利用RT-qPCR和Western Blot方法检测细胞分化第-2、0、2、4、6、8天和成熟脂肪细胞中ZBTB16基因表达量。结果显示,随着牛肌内前体脂肪细胞的分化,细胞内ZBTB16基因mRNA和蛋白表达量均呈显著递增。在前体脂肪细胞诱导分化的第0天对细胞进行腺病毒转染,并于分化第8天进行油红O染色和细胞内GPDH活性的测定。结果显示,Ad-ZBTB16组细胞内脂质含量极显著高于空白对照组和Ad-GFP组(P<0.01);Ad-ZBTB16组细胞GPDH活性显著强于空白对照组和Ad-GFP组(P<0.01)。另外分别在细胞诱导分化的第1、2和8天,使用RT-qPCR检测脂肪细胞分化关键基因PPARγ、CEBP/α和FABP4的mRNA表达水平;Western Blot检测诱导分化第8天细胞内FABP4和PPARγ的蛋白表达量。结果显示,在诱导分化的第1、2和8天,Ad-ZBTB16组PPARγ、CEBP/α、FABP4的mRNA表达量均极显著高于空白对照组和Ad-GFP组(P<0.01),蛋白测定结果与mRNA结果一致。由此可见,ZBTB16过表达对细胞增殖并无显著影响,但是能够显著促进牛肌内前体脂肪细胞的分化。第三部分:本研究旨在探究ZBTB16对牛肌内前体脂肪细胞棕色化及分化相关信号通路的影响。对牛肌内前体脂肪细胞进行腺病毒载体Ad-ZBTB16和Ad-GFP转染后,在诱导分化的第8天,RT-qPCR检测细胞中线粒体ND1基因的表达量,免疫荧光染色观察细胞中线粒体的变化。结果显示,Ad-ZBTB16组线粒体ND1基因表达量显著高于空白对照组和Ad-GFP组(P<0.05),与免疫荧光染色结果一致。在诱导分化的第8天,RT-qPCR和Western Blot分别检测细胞中UCP1基因的mRNA表达量和蛋白表达量,以及脂肪细胞棕色化相关的重要基因PRDM16、PGC-1α、CD137、Cox8b、TMEM26、Cidea和Tbx1的mRNA表达量。结果显示,Ad-ZBTB16组UCP1基因的mRNA表达量和蛋白表达量都极显著高于空白对照组和Ad-GFP组(P<0.01),Ad-ZBTB16组中PGC-1α、TMEM26和Tbx1的基因mRNA表达量都极显著高于空白对照组和 Ad-GFP 组(P<0.01),PRDM16、CD137、Cox8b和 Cidea的基因 mRNA表达量显著高于空白对照组和Ad-GFP组(P<0.05)。为进一步了解ZBTB16对牛肌内前体脂肪细胞促分化的作用机制,在腺病毒转染细胞后的0 min、15 min、1h和24 h提取细胞中的总蛋白,Western Blot检测细胞中p38 MAPK、p-p38 MAPK、p44/42 MAPK、p-p44/42 MAPK蛋白表达水平,结果显示,Ad-ZBTB16组中p38 MAPK磷酸化水平无显著变化(P>0.05),p44/42MAPK磷酸化水平极显著升高(P<0.01)。综上,我们可以初步得出结论,ZBTB16过表达能够促进牛肌内前体脂肪细胞棕色化;p44/42 MAPK信号通路可能参与了ZBTB16基因对牛肌内前体脂肪细胞促分化过程的调节。第四部分:本研究旨在验证前期试验结果,观察比较ZBTB16过表达后对牛皮下前体脂肪细胞分化和棕色化的影响。对牛皮下前体脂肪细胞进行腺病毒载体Ad-ZBTB16和Ad-GFP转染后,在诱导分化的第8天进行油红O染色和细胞中脂质含量的测定。结果显示,Ad-ZBTB16组细胞内脂质含量极显著高于空白对照组和Ad-GFP组(P<0.01),与染色观察结果一致。RT-qPCR检测诱导分化第8天细胞中与分化相关基因PPARγ、CEBP/α和FABP4的mRNA表达量,结果显示,Ad-ZBTB16组中PPARγ、CEBP/α和FABP4基因mRNA表达量均极显著高于空白对照组和Ad-GFP组(P<0.01)。腺病毒载体转染细胞后,在诱导分化的第8天,RT-qPCR检测细胞中线粒体ND1基因的表达量,免疫荧光染色观察细胞中线粒体的变化。结果显示,Ad-ZBTB16组线粒体ND1基因表达量极显著高于空白对照组和Ad-GFP组(P<0.01),与免疫荧光染色结果一致。RT-qPCR检测诱导分化第8天细胞中与脂肪细胞棕色化相关重要基因UCP1、PRDM16、PGC-1α、CD137、Cox8b 和TMEM26 的 mRNA 表达量,结果显示,Ad-ZBTB16组细胞中,UCP1、PRDM16和CD137基因的mRNA相对表达量均极显著高于空白对照组和Ad-GFP组(P<0.01),PGC-1α、Cox8b和TMEM26的mRNA相对表达量显著高于空白对照组和Ad-GFP组(P<0.05)。结果证明,ZBTB16过表达能够促进牛皮下前体脂肪细胞的分化和棕色化,与前期在牛肌内前体脂肪细胞中ZBTB16过表达结果一致。