目的:艾滋病，即获得性免疫缺陷综合症(Acquired immune deficiencysyndrome，AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的一种以CD4+T细胞减少为主要特征的严重传染病。HIV感染者患机会性感染及恶性肿瘤的几率较正常人相比大大增加，最终将面临死亡。　　在抗病毒感染和抗肿瘤免疫中发挥重要作用的细胞之一是自然杀伤细胞(Nature killer cell，NK)。NK细胞是固有免疫的重要组成成分，能够杀伤肿瘤细胞及病毒感染细胞。NK细胞杀伤功能的发挥及调节主要依靠其表面的各种活化性受体和抑制性受体来实现。肿瘤或感染细胞表面的HLA-1类分子减少，产生的外源肽或应激肽不能够被抑制性受体所识别，解除抑制的NK细胞对肿瘤或感染细胞发挥杀伤功能;而外源肽或应激肽能够被活化性受体识别，导致NK细胞活化并杀伤感染细胞。　　最近发现并命名的一种抑制性受体TIGIT(T cell immunoglobulin and ITIMdomain)，属于免疫球蛋白受体超家族成员，能够特异性的表达在免疫细胞，如NK细胞、效应和记忆T细胞、以及Treg细胞上。TIGIT受体的作用机制主要包括四点，首先TIGIT能够直接产生信号来抑制NK细胞或T细胞的功能，其次TIGIT与CD226竞争性结合配体CD155，此外TIGIT与CD155结合后，可以传递信号至配体表达细胞，使该细胞高表达IL-10，而低表达IL-12，从而间接抑制NK细胞或T细胞功能。最后，TIGIT受体还可以干扰共刺激信号，影响CD226二聚体的形成，使其不能发挥对靶细胞的细胞毒作用。　　TIGIT受体的表达与肿瘤、自身免疫性疾病以及慢性病毒感染的临床转归密切相关。肿瘤细胞高表达CD155，与TIGIT结合后，既可以直接抑制NK细胞和效应T细胞功能，又可以通过促进Treg细胞功能而间接抑制效应T细胞功能。TIGIT除了在免疫监视中具有重要作用，还有利于免疫耐受的维持，在自身免疫性疾病中具有保护作用。TIGIT低表达或缺失会增强T细胞反应，导致自身免疫性疾病的发生。目前研究发现，HIV感染者CD8+T细胞上TIGIT表达增加，阻断TGIT受体后能够恢复HIV感染者CD8+T细胞功能。可见，在HIV感染中，TIGIT有作为提高抗病毒免疫反应临床靶点的可能性。近期研究还表明，TIGIT不仅表达在T细胞上，还表达在NK细胞上，并且正常人中TIGIT在NK细胞上的表达量是最高的，提示TIGIT与NK细胞的关系较T细胞更加密切，但HIV感染者NK细胞TIGIT的表达变化及TIGIT表达与NK细胞功能的关系，目前尚没有研究。　　本研究主要针对NK细胞上TIGIT受体开展研究，明确HIV感染者NK细胞TIGIT受体的表达情况，探索调节NK细胞TIGIT表达的相关因素，明确NK细胞TIGIT受体的表达与NK细胞功能的关系，为采取相关干预措施，提高HIV感染者NK细胞功能，增强免疫反应提供参考依据。　　材料与方法:　　1、研究对象　　本研究共选取实验对象133例，其中，HIV抗体阴性的健康人(normal control，NC)48例，入选的标准为血常规及肝功能正常、乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗体阴性，无免疫系统疾病;根据中华人民共和国国家HIV/AIDS诊断标准，选取未接受过抗逆转录病毒治疗的HIV慢性感染者85例，均来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊。　　2、CD4+T细胞绝对值计数　　将20μl的CD4/CD8/CD3TriTEST试剂加入到绝对计数管中，逆向加样法加入50μl EDTA抗凝全血，混匀后室温避光染色15min。加入10倍稀释的免洗溶血素450μl，混匀后室温避光15min。用BD FACSCalibur流式细胞仪中的MultiSET软件进行检测并自动分析。　　3、HIV病毒载量测定　　采用Roche公司The COBAS(@)AmpliPrep(@)/COBAS(@)TaqMan(@) HIV-1 Test试剂盒在COBAS(@)TaqMan(@)系统进行全自动PCR反应体系制备及病毒载量检测。检测下限为20拷贝/ml。　　4、细胞表面染色　　新鲜全血提取外周血单个核细胞即PBMC，用anti-CD3-PerCP、anti-CD4-APC-cy7、 anti-CD56-PE-CY7、anti-CD16-APC、anti-TIGIT-PE或anti-TIGIT-APC、anti-CD226-FITC、anti-CD155-PE荧光抗体对细胞进行表面染色，室温避光20分钟后，用PBS洗涤一遍，然后1％多聚甲醛固定。最后用LSRⅡ流式细胞仪进行检测，BD FACSDivaTM软件进行分析。　　5、体外不同刺激检测NK细胞TIGIT表达情况　　新鲜全血提取PBMC，置于96微孔板中，加入不同刺激物后，用完全1640（含10％FBS和1％青链霉素）补充体系至200μL，放置CO2培养箱中培养24h。24小时后用2％FBS收集细胞，重悬后加入anti-CD3-PerCP、anti-CD56-PE-CY7、anti-TIGIT-APC anti-CD226-FITC荧光抗体进行表面染色，流式细胞仪LSR II检测。　　6、流式细胞仪检测IFN-γ分泌　　提取PBMC，用流式分选仪Aria分选出TIGITNK细胞和TIGIT+NK细胞，置于96微孔板中，加入rIL-12和rIL-15，完全1640将体系体积补充至200μL，放置CO2培养箱中37℃培养24h。并于收细胞前的6小时，每孔加入Golgistop1μL。培养24小时后用收集细胞，并将细胞重悬后破膜，加入anti-IFN-γ-FITC进行胞内染色，固定细胞后，用LSRⅡ流式细胞仪中的BD FACSDivaTM软件进行检测分析。　　7、流式细胞仪检测颗粒酶与穿孔素　　PBMC加入anti-CD3-PerCP、anti-CD56-PE-Cy7及anti-TIGIT-APC进行表面染色，然后破膜，加入anti-Granzyme B-FITC和anti-Perforin-PE进行胞内染色，最后固定细胞，上LSRII流式细胞仪检测TIGIT-NK细胞与TIGIT+NK细胞所具有的颗粒酶与穿孔素的含量。　　8、与NK细胞功能相关的阻断实验　　PBMC置于96微孔板中，加入rIL-12和rIL-15，以及anti-CD107a-BV510荧光染料，再分别加入不同阻断剂后补充体系至200μL，放置CO2培养箱中培养24h。收细胞前6小时，每孔加入Golgistop1μL。培养24小时后收集细胞，重悬后加入anti-CD3-PerCP、anti-CD56-PE-Cy7进行表面染色。然后破膜，进行anti-IFN-γ-APC胞内染色，1％多聚甲醛固定细胞，利用LSRⅡ流式细胞仪检测NK细胞分泌IFN-γ或CD107a的能力。　　9、统计学分析　　应用GraphPad Prism5.0软件进行统计学分析，所有实验数据均以中位数表示，两组间独立样本的比较采用Mann-WhitneyU检验，相关性分析采用Spearman秩相关检验，P＜0.05为有统计学意义;多组间两两比较采用Wilcoxon signed rank检验，P＜调整后的检验水准α为有统计学意义。　　结果:　　1、HIV感染者NK细胞TIGIT表达升高　　HIV感染者NK细胞上TIGIT表达与正常对照NC相比，明显增加(P=0.0016)。且NK细胞上TIGIT表达与CD4+T细胞计数呈负相关趋势(P=0.0310)。根据CD4+T细胞计数高低分组:CD4+T细胞计数≤350cells/μl组NK细胞TIGIT表达量明显高于CD4+T细胞计数＞350cells/μl组(P=0.0117)。　　2、HIV感染者NK细胞不同亚群TIGIT表达情况　　HIV感染者CD56brightCD16-/+NK细胞亚群与正常对照相比，无明显变化(P=0.9468)，CD56dimCD16+NK细胞亚群与正常对照相比，显著增加(P=0.0021)，CD56-CD16+NK细胞亚群与正常对照相比，显著增加(P=0.0001)，CD56dimCD16-NK细胞亚群与正常对照相比，显著增加(P=0.0211)。　　3、HIV感染者TIGIT配体CD155表达升高　　HIV感染者CD4+T细胞表面CD155的表达与NC组相比较，明显增加(P=0.0121)。　　4、识别同一配体的TIGIT和CD226在HIV感染者中共表达升高　　HIV感染者TIGIT+CD226+NK细胞与NC组相比，显著增加(P=0.0232)，TIGIT-CD226+NK细胞显著减少(P=0.0060)，而TIGIT+CD226-NK细胞及TIGIT-CD226-NK细胞与正常对照NC组相比无明显变化。　　5、NK细胞TIGIT表达的调节　　rIL-12和rIL-15共同作用能够促进NK细胞TIGIT和CD226的表达(P=0.0296，P=0.0237，P=0.0047)，IL-10不能够调节NK细胞TIGIT的表达，但能够促进NK细胞CD226的表达(P=0.0267，P=0.0102)，同样TGF-β也不能调节NK细胞TIGIT的表达，但能促进NK细胞CD226的表达(P=0.0114)。　　6、TIGIT能够抑制NK细胞功能　　HIV感染者分泌IFN-γ的能力远低于正常对照组NC(P=0.0454)，且TIGIT+NK细胞分泌IFN-γ的分泌能力低于TIGIT-NK细胞(P=0.0409)。TIGIT+NK细胞百分比与IFN-γ+NK细胞百分比呈负相关(P=0.0052)。TIGIT+NK细胞含有的Granzyme B多于TIGIT-NK细胞(P=0.0252)。　　7、阻断TIGIT能够恢复HIV感染者NK细胞功能　　体外加入rTIGIT蛋白后，HIV感染者NK细胞分泌IFN-γ增加(P=0.0005)，分泌CD107a增加(P=0.0180)。体外加入anti-TIGIT阻断抗体后，HIV感染者NK细胞分泌IFN-γ能力有所恢复(P=0.0318)，分泌CD107a同样有所恢复，但无统计学差异(P=0.0740)。　　8、阻断CD155能够提高NK细胞功能，阻断CD226能够降低NK细胞功能　　阻断CD155后，HIV感染者NK细胞分泌IFN-γ增加(P=0.0385)，阻断CD226后，HIV感染者NK细胞分泌IFN-γ降低(P=0.0124)。　　结论:　　1、 HIV感染者NK细胞及相关亚群（CD56dimCD16+NK细胞亚群、CD56-CD16+NK细胞亚群、CD56dimCD16-NK细胞亚群）TIGIT表达显著增加。　　2、rIL-12与rIL-15联合可以上调HIV感染者NK细胞TIGIT表达。　　3、TIGIT+NK细胞分泌IFN-γ能力低于TIGIT-NK细胞分泌IFN-γ能力，且TIGIT+NK细胞百分比与IFN-γ+NK细胞百分比呈负相关。　　4、阻断TIGIT后NK细胞分泌IFN-γ增加，阻断CD155后NK细胞分泌IFN-γ增加，阻断CD226后NK细胞分泌IFN-γ降低。