【摘 要】
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蜘蛛丝既质轻又坚韧,是一种集强固性与柔韧性于一体的综合性能优良的天然蛋白质纤维,作为高性能材料在工业、军事如降落伞绳索、轻质吸能的军事防护服、航天用复合材料等方面
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蜘蛛丝既质轻又坚韧,是一种集强固性与柔韧性于一体的综合性能优良的天然蛋白质纤维,作为高性能材料在工业、军事如降落伞绳索、轻质吸能的军事防护服、航天用复合材料等方面有重要的应用价值。同时蜘蛛丝具有良好的生物相容性和可降解性,在生物医学领域如手术缝合材料、人工肌腱、药物运转载体、组织支架等方面极具潜在开发价值。但是由于天然蜘蛛丝产量少而且无法对蜘蛛进行规模饲养,通过基因工程技术来大量获取蜘蛛丝是人们研究和解决纤维材料来源问题的一条途径。
在基因工程中微生物表达系统有着生长快、产量高、周期短、培养条件简单、遗传背景清楚且开发有多种表达载体、菌株和纯化系统的优点,天然的或者人工合成的蜘蛛丝蛋白最初都在大肠杆菌、酵母等微生物表达系统中进行表达,现已开发出多种蜘蛛丝蛋白表达系统。由于对蜘蛛丝蛋白后期组装、纺丝机理等相关研究相对滞后,目前的研究还未能把获得的蜘蛛丝蛋白形成力学性能理想的丝纤维。家蚕是被人类驯化并得到充分利用的泌丝昆虫。家蚕丝腺具有强大的合成和分泌蛋白的能力,其分泌的蚕丝和蜘蛛丝一样富含甘氨酸和丙氨酸。利用家蚕丝腺高效的蛋白质表达系统表达蜘蛛丝蛋白,并通过其天然的纺丝系统将重组蛛丝蛋白分泌并纺丝,可以轻松解决其它表达系统存在的后期纺丝困难的问题,是外源表达蜘蛛丝蛋白获得高性能丝纤维材料最有希望的表达系统。
本研究通过PCR方法从络新妇属棒络新妇蜘蛛(Nephila clavata)基因组DNA中克隆获得拖牵丝蛋白基因的部分序列,对该基因编码的蛋白质进行预测分析表明其氨基酸存在蜘蛛拖牵丝蛋白典型(A)n、(GGX)n模序.螺旋结构占优势,具有蜘蛛大壶状腺丝蛋白结构域。将克隆基因与载体pET-28α(+)连接构建原核表达载体pET28-NcMaSp,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行拖牵丝蛋白的表达,SDS-PAGE显示表达分子量与预期一致约为27kD,表达的蛋白具可溶性部分以包涵体形式存在。在此基础上通过原核表达载体自身携带的His标签,对表达的重组蜘蛛丝蛋白进行通过镍柱亲和层析进行纯化,为下一步的真核表达做好准备工作。
选用家蚕丝腺表达系统进行蜘蛛拖牵丝蛋白基因的真核表达。从家蚕品种大造(P50)中克隆了ser1基因启动子、ser1基因3端终止子,人工合成ser1基因信号肽编码序列。Ser1基因启动子序列分析表明,家蚕ser1基冈启动子的TATA框保守序列为TATAAAA(-24～-30),CAAT框位于-112～-115处。对ser1基冈信号肽编码序列与拖牵丝蛋白编码序列形成的融合蛋白进行信号肽剪切位点预测,显示信号肽剪切位点位于20-21位氨基酸。在序列分析的基础上构建重组质粒pFFa[MCS-ser1-signal-NcMaSp1-ser3],将该重组质粒的ser1-signal-NcMaSp1-ser3融合片段与携带报告基因的pinggyBac[3xp3-DsRed]转座载体融合构建丝腺特异表达基因ser1启动子驱动的转基因表达载体piggyBac[ser1-signal-NcMaSp1-ser3,3xp3-DsRed],并进行了转基因注射。为后续分析该转基因家蚕茧丝特性,定向改造转蜘蛛拖牵丝基因家蚕蚕丝的结构与性能,开发高性能丝纤维材料的研究奠定基础。
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