论文部分内容阅读
卵泡选择是当前家禽繁殖生物学的热点,研究卵泡选择的分子机制有助于充分开发母鸡卵巢内丰富的卵泡资源,提高母鸡的产蛋和繁殖性能。卵泡的选择主要依赖垂体分泌的FSH调控以及受体FSHR的表达,FSHR表达量高的卵泡响应FSH的刺激。近几年研究发现,lncRNA、miRNA等非编码RNA在调控细胞分化,转录激活与转录干扰等生物学过程中起到了不可忽视的作用,但对于其如何影响动物卵巢卵泡的发育还知之甚少,特别是对禽类卵巢卵泡发育和选择的影响鲜有报道。本研究对产蛋高峰期济宁百日鸡不同FSHR表达量的小黄卵泡进行了全转录组测序,对随机选择的30个mRNA、lncRNA和miRNA进行了定量验证,对筛选出的mRNA,lncRNA和miRNA以及它们的靶基因进行了初步研究和生物信息学分析。结果如下:1.鸡小黄卵泡的全转录组测序数据的基本统计。样本SY1获得99105865个高质量读数,占原始数据的98.87%,检测到42794个mRNA、8011个ncRNA和200个miRNA。样本SY2获得10605080个高质量读数,占原始数据的98.83%,检测到42850个mRNA、8138个ncRNA和229个miRNA。2.不同FSHR表达水平小黄卵泡的差异表达基因筛选、验证及功能预测。测序筛选出样本间815个显著差异表达mRNA,其中223个显著上调,592个显著下调,分析结果发现这些差异表达基因多集中在细胞进程相关的吞噬、环境信息处理相关的神经活性配体-受体相互作用等相关通路,功能注释发现这些基因显著富集在胞外区、应答外部刺激等方面;筛选出134个显著差异表达lncRNA,其中52个显著上调和82个显著下调,选择29个显著表达差异lncRNA预测其靶基因,发现靶基因多富集在代谢途径、FoxO等信号通路,大多数在结合、细胞、细胞结构等方面显著富集;筛选出样本间34个显著差异表达miRNA,其中3个显著上调,31个显著下调,选择33个差异倍数较大miRNA预测其靶基因,发现其靶基因多富集在糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、神经活性配体-受体相互作用等相关通路,功能注释发现大多数基因在结合、单生物体过程、生物调节、膜等方面显著富集。3.鸡小黄卵泡差异表达mRNA、miRNA和lncRNA的整合分析结果。近年来,研究人员已经发现,lncRNA和miRNA之间相互作用,共同调节靶基因的表达水平。例如,lncRNA可通过竞争性结合的miRNA增加靶基因的表达水平。通过比较差异表达的基因,差异表达lncRNA靶基因和差异表达miRNA靶基因三者之间的关系,发现基因SowahA是miRNA-6615-3p、miRNA-1560-3p、miRNA-3540和lncRNA-210520.2的共同靶基因。分析测序结果发现在FSHR表达水平高的卵泡中SowahA和lncRNA-210520.2的表达水平也高,而三种miRNA的表达水平则较低。4.lncRNA-210520.2在鸡卵泡中的功能。针对lncRNA-210520.2设计siRNA并转染到等级卵泡颗粒细胞后,定量分析发现:在显著降低了lncRNA-210520.2的表达量后,靶基因SowahA的表达量出现了显著的上调,而三种miRNA的表达量没有发生显著的变化;CYP11A1的表达量在siRNA干扰lncRNA-210520.2后出现了显著上调;转染siRNA后等级卵泡颗粒细胞增殖速率显著升高。说明抑制lncRNA-210520.2低表达量能增加类固醇激素的水平,刺激卵泡颗粒细胞的增殖。综上所述,本文对FSHR不同表达水平的鸡小黄卵泡进行了全转录组测序,筛选出大量差异表达mRNA、lncRNA和miRNA,整合分析表明SowahA是miRNA-6615-3p、miRNA-1560-3p、miRNA-3540和lncRNA-210520.2的共同靶基因。在鸡卵泡发育中lncRNA-210520.2具有抑制类固醇激素水平和卵泡颗粒细胞增殖的效应。这些结果为进一步阐明禽类卵巢卵泡的选择的分子机制奠定了基础。