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c-FLIP(cellular FLICE-like inhibitory protein)是一种凋亡抑制蛋白,作为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶caspase-8的同源类似物,通过自身的死亡效应结构域(DEDs)竞争性结合凋亡接头蛋白FADD抑制caspase-8的激活,发挥凋亡抑制功能。近年来,随着肿瘤治疗研究的深入,c-FLIP作为重要的靶蛋白越来越被重视,除了经典的抗凋亡功能外,c-FLIP还参与细胞增殖,激活NF-κB,ERK/AP-1及β-catenin等途径,为细胞生存提供多重保护。 肿瘤细胞的增殖失控、分化异常以及迁移/浸润能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征,特别是肿瘤细胞的迁移和浸润对抗肿瘤治疗有十分重要的意义。在前期的实验中,采用六种分化程度不同的肺癌细胞株95C,spcA1,A549,H446,H1299,PC9进行分析,发现肺癌细胞迁移能力与c-FLIP表达水平呈正相关。目前对于c-FLIP参与细胞迁移的机制还没有明确的报道,为了研究c-FLIP参与细胞迁移的的分子机制,我们从c-FLIP的功能结构域入手进行探索。目前已知c-FLIP主要结构域:N-端的死亡效应结构域(DEDs)和C-端的无酶活的Caspase-8样同源结构域(C8-L)。实验中第一部分构建了各结构域变体的稳定细胞株,即:A549-pcDNA3.1(-),A549-cFLIP,A549-C8-L和A549-DED,为后续研究搭建了细胞平台;第二部分的实验借助RTCA,Transwell,Wound-healing等实验技术,检测c-FLIP及其变体对细胞增殖、细胞迁移能力的影响。实验结果证明,Caspase-8样结构域介导c-FLIP参与细胞迁移。 文献中普遍认为,细胞迁移与EMT过程密切相关。肿瘤细胞经历EMT获得转移、侵袭能力,从原发肿瘤组织脱落,迁移到邻近的器官或向远端转移,并且对传统的化疗药物治疗产生抵抗和耐药性。那么在肺癌细胞中c-FLIP异常表达而增强的细胞迁移能力是否与EMT发生相关?第三部分围绕c-FLIP及其变体与EMT发生展开研究,在蛋白水平和转录水平上分别检测EMT标志性分子表达的变化(如:E-cadherin,Vimentin,Fibronectin等),结果显示:c-FLIP与Caspase-8样结构域促进EMT发生。进一步探究c-FLIP参与EMT的分子机制,采用TGF-β1诱导EMT发生,检测主要信号途径:Smad依赖途径和Smad非依赖途径(PI3K/Akt,NF-κB和Wnt)的变化。在过表达体系和干扰体系中,通过检测报告基因激活程度和信号通路关键蛋白质的磷酸化水平变化,寻找c-FLIP作用途径。结果发现,c-FLIP与Caspase-8样结构域能够增强肺癌细胞对TGF-β1的应答,激活Smad依赖的信号途径。而相应的干扰c-FLIP表达则抑制EMT过程的发生。由此,我们得到结论:肺癌细胞中c-FLIP通过其Caspase-8样结构域参与Smad信号通路的激活促进EMT发生。