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农业是人类社会发展不可缺少的基础，农业生产取决于水分以及气候条件，并且受农业研究成果的影响，随着世界人口的增加，人类对粮食的需求量越来越大，而环境的恶化以及资源的缺乏，将导致人类对能源和食物的竞争，因此作物产量的提高成为农业研究急需解决的问题。研究证明C4光合作用效率高于C（3小麦，水稻等）光合效率，将C4途径转入到C3作物中可能会使C3植物提高50%的产量，并且可以提高水分利用率同时降低对肥料的需求，因此，通过生物技术手段使C3植物行使C4光合途径是提高粮食产量最直接有效的手段。C4光合作用是陆生植物主要的光合作用方式，花环结构是C4植物最典型的解剖学结构，表现为两种形态的光合细胞围绕维管。C4光合途径中的RuBP具有氧化/脱羧双重作用，其活性的高低取决于细胞内CO2/O2的分压，C4植物的CO2浓缩机制使维管束鞘细胞中的CO2分压升高，因此可以降低光呼吸过程中CO2的流失。在植物叶片中光呼吸大约消耗了光合作用所固定CO2的四分之一，此外，在多数植物中暗呼吸又消耗掉了碳固定的另外30-40%，因此，降低呼吸作用过程中的碳消耗是提高植物产量的有效途径，然而呼吸是植物生长必需的，并且呼吸速率是衡量植物生长速率的一个指标，尽管之前有实验建议选择暗呼吸降低的基因型来提高作物的产量，但是随后Kraus和Lambers（2001）的研究表明产量的提高与呼吸速率并不相关，尽管通过光合作用提高光呼吸释放的CO2重固定实验已经获得初步的成功，然而通过生物技术手段改变呼吸速率进而直接影响植物生长速率还需要进一步的研究。碳酸酐酶是一种含锌金属酶，催化生物体内CO2与HCO3-之间的可逆水合反应，广泛存在于植物、动物和微生物中，并在代谢过程中起重要作用。在C4植物中，胞质中的CA是将CO2水合为HCO3-提供给PEPC所必需的，也是羧化反应中CO2浓缩机制的开始。在C3植物中也存在PEPC酶的活性，并且在氨基酸的产生过程中作为中间产物补充柠檬酸循环，研究表明一些胞质或者线粒体中CA的活性也起到相同的作用途径。尽管在生态和经济方面C4光合都很重要，但是C4光合途径发现以来，有关C4遗传控制机理的研究一直没有突破性进展，C4花环结构的遗传机制尚不明确，并且迄今为止尚未鉴定到与C4途径密切相关联的转录因子、激酶、磷酸化酶或者受体。因此，对于C4相关基因的研究尤为重要，CA在光合作用途径的碳固定中起到重要作用，对CA的作用机制进行深入的研究对研究C4光合具有重要意义。拟南芥具有三个CA基因家族，其中AtβCA6经生物信息学预测其定位于线粒体中，并且研究证实该基因在低CO2条件下表达量上升，因此预测其可能与线粒体呼吸释放的CO2的再固定有关，进而研究了AtβCA6的基因功能。作者自ABRC订购了AtβCA6基因的T-DNA插入突变体（Salk-065611），对AtβCA6基因的功能进行了系统的研究。主要实验结果如下：1.通过PCR及测序检测对T-DNA插入AtβCA6基因的位置进行鉴定。Salk-065611突变体中T-DNA插入到AT1G58180基因的第七内含子上，突变体的纯合子中检测不到AtβCA6基因的转录产物。2.通过对基因At1g58180的启动子区（ATG上游的1-1350bp）调控的GUS表达分析该基因的组织特异性表达，研究发现该基因在拟南芥的整株中均有表达，包括植物的根、茎和叶等。应用PlantCARE和PLACE软件分析，发现基因AtβCA6的启动子除了含有必需的起始转录位点、TATA-BOX、CAAT增强子外，还包含多个调控元件:如光应答元件、水杨酸应答元件、胁迫答元件、热激应答元件等。同时发现在1105bp处可能含有一个顺式作用元件（GANTTNC），该元件在衣藻中与CO2应答有关。通过对该基因启动子的CO2应答元件研究发现，该基因的启动子在464-726bp区域可能存在CO2的应答元件，而在726-1000bp区域可能存在启动子功能抑制因子。3.本文构建了35S启动子启动的C端融合GFP载体以及内源启动子启动的N端和C端融合GFP的载体，并获得转基因植株，通过观察转基因植株中绿色荧光的亚细胞定位发现AtβCA6基因定位于拟南芥的线粒体中，并且基因的N端与GFP融合后在植物中检测不到绿色荧光信号。4.通过将过量表达载体浸染拟南芥野生型和突变体Salk065611获得过量表达转基因株系OE和基因敲除突变体背景下的过量表达转基因株系CM，并通过定量PCR的方法筛选出5个表达量远远高于WT的OE株系和5个表达量类似WT的CM株系。通过对比一个月大的植株发现，OE植株明显大于其他株系，而Salk065611株系最小，与WT相比，过量表达AtβCA6可以明显提高植株地上部分的鲜重和干重，而AtβCA6基因敲除突变体Salk065611则相反，CM株系的莲座叶面积和生物量等均与WT相似。通过对比各株系的光合速率和呼吸速率发现，OE株系的光合速率相对较高，但是各株系之间的差异不显著。与WT相比，OE株系具有相对较低的呼吸速率而基因敲除突变体Salk065611具有相对较高的呼吸速率。通过分析CO2响应曲线进而分析光合作用与内源CO2浓度的关系发现，WT，Salk065611，OE和CM的CO2补偿点分别为75±8ppm、88±9ppm、74±5ppm、和77±9ppm，这一结果与低CO2条件下Salk065611株系生长受抑制最明显，而OE植株最大相吻合。5.利用Illumina HiSeq2000平台对拟南芥野生型和突变体Salk065611进行测序，每个样品获得长度为100bp的读段数5300万条，过滤掉低质量的读段数后剩余4700万条（89.5%）用于比对，通过TopHat将筛选后的读段比对到拟南芥基因组上。利用GO将比对到基因组上的基因进行分组并利用MapMan对基因进行注释，本次试验共有23826个基因比对到拟南芥的基因组上，从这些基因中筛选出P value和FDR值均小于0.05的基因共101个，这101个基因中有26个基因上调，75个基因下调，并通过定量PCR验证。筛选出的101个基因与代谢、离子转运、信号转导、蛋白修饰、转录因子、磷酸化作用以及胁迫响应有关。6.利用核磁共振谱仪对拟南芥野生型和突变体Salk065611进行代谢组的检测，共准确鉴定出38种代谢产物，其中包括16种氨基酸、6种糖类代谢物、7种有机酸、2种醇类化合物和7种其他化合物。通过对代谢组的PCA分析和PLS-DA分析发现，WT组和Salk065611组内的样本具有高重复性，两组间具有明显差异。通过对各代谢物含量进行统计分析发现，大部分的糖类物质以及有机酸在突变体Salk065611中下降，且差异显著，而大部分的氨基酸类物质在突变体Salk065611含量上升。本文主要创新点：首次对拟南芥碳酸酐酶AtβCA6进行了系统的研究，深入研究了该基因的启动子功能元件、亚细胞定位、基因功能、突变体Salk065611转录组以及代谢组分析，对该基因的功能进行了系统的阐述，对C4光合研究具有重要意义。