【摘 要】
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[目的]1、探讨RhoA蛋白在人体胆囊癌组织的表达情况。2、通过体外细胞实验研究RhoA基因干扰对胆囊癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。3、通过体外细胞实验明确EIF5A2基因干扰对胆囊癌细胞中RhoA、ROCKI蛋白表达的影响。[方法]1、本实验用到的24对胆囊癌、胆囊炎的石蜡切片,均来源于昆明医科大学第二附属医院肝胆外科,运用免疫组织化学法并通过DAB显色,通过平均MOD检测RhoA蛋白在胆囊癌组
【基金项目】
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2016年度云南省医疗卫生单位内设研究机构科研项目（2016NS250）；
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[目的]1、探讨RhoA蛋白在人体胆囊癌组织的表达情况。2、通过体外细胞实验研究RhoA基因干扰对胆囊癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。3、通过体外细胞实验明确EIF5A2基因干扰对胆囊癌细胞中RhoA、ROCKI蛋白表达的影响。[方法]1、本实验用到的24对胆囊癌、胆囊炎的石蜡切片,均来源于昆明医科大学第二附属医院肝胆外科,运用免疫组织化学法并通过DAB显色,通过平均MOD检测RhoA蛋白在胆囊癌组织及胆囊炎组织的表达量,两组MOD值符合正态分布,运用SPSS23软件独立样本t检验分析二者是否具有差异。2、培养胆囊癌细胞系、调整细胞状态,合成3条设计的siRNA-RhoA并筛选效果优的一条,采用瞬时转染的方法进行实验,分组如下:siRNA-NC组、siRNA-RhoA组,采用qPCR、Western Blot技术检测细胞处理后RhoA、ROCK Ⅰ的mRNA及蛋白表达变化,通过CCK-8的方法分别检测siRNA-NC组、siRNA-RhoA组细胞处理后的第0h、第12h、第24h、第48h以及72h的增殖变化情况,通过细胞划痕方法来分别检测siRNA-NC组、siRNA-RhoA组细胞处理后的迁移能力变化趋势,通过Transwell的方法分别检测siRNA-NC组、siRNA-RhoA组细胞处理后的侵袭能力;运用GraphPad prism8分析数据并制图。3、培养胆囊癌细胞系、调整细胞状态,合成设计好的siRNA-EIF5A2（本研究小组已验证并提供对应序列）,采用瞬时转染的方法进行实验,分组如下:siRNA-NC 组、siRNA-EIF5A2 组,采用 Western Blot 检测细胞处理 48h 的 RhoA、ROCK Ⅰ蛋白的表达变化;运用GraphPad prism 8分析数据并制图。[结果]1、通过显微镜在×200镜下观察组织切片发现RhoA蛋白在人体胆囊癌、胆囊炎组织中均表达,用Imagepro Plus软件计算分析MOD,胆囊癌MOD为:24771±18373、胆囊炎MOD为7674±4275,两者差异有统计学意义（P=0.003）,本次实验证明RhoA蛋白在人体胆囊癌组织表达量显著增高。2、qPCR检测RhoA基因的表达量,以GAPDH为内参,结果提示siRNA-RhoA组RhoA的mRNA表达水平（0.067±0.006）显著低于siRNA-NC组（1.467±0.428）,两组在RhoA基因的相对表达量有明显的数理统计差异（P=0.005）,结果表明:本实验中所设计的这一对siRNA可以较好的抑制RhoA基因在RNA水平上的表达。根据Western Blot结果提示:siRNA-RhoA组RhoA、ROCK Ⅰ蛋白的条带弱于siRNA-NC组,siRNA-RhoA组的RhoA、ROCKI蛋白表达水平显著低于siR NA-NC组（P<0.001、P<0.001）,这说明本实验中设计的这一对siRNA在蛋白质水平上同样能够对胆囊癌细胞的RhoA基因起到很好的抑制作用,同时降低ROCK Ⅰ编码蛋白。根据CCK-8结果:在转染24h、48h以及72h后,分析得出siRNA-NC组、siRNA-RhoA组GBC-SD细胞的A450吸光度值出现了明显的差异（P=0.005;P=0.004;P=0.001）,其P值均小于0.05,72h差异最为显著。说明干扰RhoA基因可以抑制人体胆囊癌细胞增殖能力。根据划痕实验的结果:通过划痕面积,计算伤口愈合百分比,siRNA-RhoA组细胞迁移能力减弱,与siRNA-NC组差异具有统计学意义（P=0.007）。Transwell侵袭实验:随机选择三个小室通过显微镜在×100镜下进行细胞计数,siRNA-RhoA 组（98.667±11.504）,siRNA-NC 组（162.333±17.785）,siRNA-RhoA组的GBC-SD侵袭能力降低,两组有显著差异（P=0.006）。3、Western Blot结果提示:与对照组相比,siRNA-EIF5A2组RhoA蛋白、ROCK Ⅰ蛋白的条带较弱,siRNA-EIF5A2组的RhoA蛋白表达水平显著低于siRNA-NC 组（P<0.001）,ROCK1 表达也降低（P=0.047）,Western Blot 结果说明:本实验中运用的EIF5A2-siRNA能抑制胆囊癌细胞的RhoA、ROCKⅠ蛋白表达。[结论]1、RhoA蛋白在人体胆囊癌、胆囊炎组织中表达,且在人体胆囊癌组织中呈高表达。2、本实验用到的RhoA-siRNA对体外胆囊癌细胞的RhoA基因表达具有一定的抑制作用;沉默RhoA基因,能够抑制体外胆囊癌细胞增殖及迁移侵袭能力。3、降低体外胆囊癌细胞EIF5A2基因的表达,可使RhoA、ROCKⅠ蛋白表达均下降。
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