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石斛自古为名贵中药材,在《神农本草经》中被列为上品。中药石斛来源于兰科Dendrobium Sw.属多种植物,其主要品种的植物学名为:石斛Dendrobium nobileLindl.。此品种即人们常说的“金钗石斛”,李时珍谓“其茎状如金钗之股,故古有金钗石斛之称”,其名早在唐代《道藏》之《太上肘后玉经方》中就已见载,历代中医处方所用石斛主要为此品种,其药用功效已被历代中医临床和现代药理研究所证实,且其关键活性成分为生物碱类成分。金钗石斛生物碱类成分的常规提取方法为有机溶剂回流法,在节能、降耗、减污方面不具优势,开发绿色提取技术很有必要。中药石斛也具有药食两用属性,例如,在金钗石斛的主产地赤水-合江区域有“石斛老鸭汤”的传统菜品,而铁皮石斛D.officinale也将作为按照传统既是食品又是中药材物质管理（据国卫办食品函[2018]278号文件）。但不同植物来源的石斛化学成分差异很大,金钗与铁皮相比,总生物碱含量前者远高于后者,而多糖含量后者远高于前者。化学成分的差异可能意味着活性和安全性存在差异。有关金钗石斛安全性的零星报道显示其毒性很低,但早在1936年医学家经利彬已通过实验表明其浸膏有心脏抑制作用,故进一步进行安全性评价对于认识其药食两用的范畴很有意义。基于以上因素,本论文着眼于金钗石斛生物碱的绿色制备工艺、活性和安全性展开了系列研究。1、优化了酸性染料比色法定量测定金钗石斛总生物碱的方法。确定了以柠檬酸缓冲液、溴甲酚绿、三氯甲烷和未碱化络合物作为酸性染料比色法的实验条件,来定量测定总生物碱的含量;通过均匀设计法优化得到最佳条件为:pH为3的柠檬酸缓冲液1ml,溴甲酚绿酸性染料1.5ml,三氯甲烷3ml。该方法重复性、稳定性良好,加标回收率高。2、探讨了超临界流体萃取技术提取金钗石斛总生物碱的绿色工艺。利用正交方法确定了其最佳条件为:90%乙醇、萃取温度70℃、萃取压力30MPa,萃取时间1.5h,该方法提取总生物碱的收率为0.313%。与乙醇索式抽提方法相比,超临界法收率是后者两倍。3、探讨了天然低共熔溶剂（NADESs）法提取金钗石斛总生物碱的绿色工艺,并对大孔树脂法初步纯化总生物碱和回收利用天然低共熔溶液（NADES）进行了研究。利用单因素实验确定了NADES为氯化胆碱与甘油以1:2合成的共熔物、超声提取方式及各因素的最佳值,并进行了四因素三水平响应面实验,经RSM分析优化得到NADES对总生物碱的最佳提取方法,其各条件为:水比例20%、料液比20ml/g、提取温度35℃、提取时间30min。将该方法与文献报道的方法进行比较,发现氯化胆碱和甘油组成的NADES溶液提取收率为0.440%,其收率高于试验比较方法的两倍左右。另外,通过斑马鱼鱼类急性毒性试验考察了该NADES毒性,发现该NADES的半数致死浓度(LC50)为58.80g/L,远低于国家规定的化学品毒性标准。此外,对大孔树脂法初步纯化总生物碱和回收NADES进行了研究。比较了四种大孔树脂对总生物碱的吸附和解析能力,发现D101大孔树脂最佳,并确定了初步纯化总生物碱的方法,得到总生物碱收率为84.12%及NADES第二次重复收率可达98.66%。4、对超临界法提取物、NADES法提取物、NADES联合大孔树脂法纯化物三种样品进行了LC-MS分析。发现各样品中主要都含dendramine、石斛碱两种生物碱和β-sitosterol,石斛碱居多。因此,通过GC定量测定三种样品石斛碱的收率分别为:超临界法提取物0.229%、NADES法提取物0.404%、NADES联合大孔树脂法纯化物0.402%,表明得到的生物碱样品主要成分为石斛碱。5、利用DPPH法、ABTS法及铁氰化钾法测定了超临界法提取物、NADES法提取物、NADES联合大孔树脂法纯化物样品的抗氧化能力。NADES联合大孔树脂法纯化物对DPPH·自由基清除率最高,其半数抑制浓度IC50为0.907 mg/ml,NADES法提取物对ABTS+·自由基清除效果最好,其IC50为1.023 mg/ml。NADES联合大孔树脂法纯化物的还原能力最强。表明三种总生物碱样品都具有一定的抗氧化能力,但都低于Vc。6、研究了金钗石斛醇提物的不同萃取部位对斑马鱼的胚胎毒性,发现乙酸乙酯萃取物毒性最大,经LC-MS分析发现其主要成分为石斛碱。在此基础上,进一步深入研究了石斛碱对斑马鱼胚胎的毒性,主要通过观察各形态学指标,测定细胞凋亡情况,以及测定发生氧化应激时SOD酶活性和MDA含量来说明石斛碱对斑马鱼胚胎的毒性作用。结果表明,石斛碱与乙酸乙酯萃取物对斑马鱼胚胎的毒性作用一致(LC50分别为0.207mg/ml、0.504mg/ml),主要表现为心包肿大、心率下降,说明乙酸乙酯萃取物的主要毒性成分为石斛碱。试验表明,随着石斛碱的浓度增加,其对斑马鱼的毒性作用增强（在140mg/L浓度时开始出现死亡）;斑马鱼死亡率与石斛碱浓度和处理时间都具有一定相关性;石斛碱80mg/L对斑马鱼胚胎具有明显的致畸作用。试验中还发现,石斛碱浓度与细胞凋亡情况呈正相关,表明石斛碱诱导了斑马鱼胚胎的细胞凋亡;并且,SOD酶活性增加、MDA量减少,表明石斛碱引起了斑马鱼胚胎的氧化应激,发生致畸作用;同时,随着石斛碱浓度和处理时间的增加,对斑马鱼胚胎毒性越大,细胞凋亡、氧化应激越明显。