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女性癌症患者的放和/或化疗可严重影响卵巢储备功能进而导致卵巢功能衰退。由于近年来诊疗技术的完善使得女性癌症患者尤其是年轻患者的长期存活率得到极大改善,但因放和/或化疗造成的女性生殖腺的损害却引起极大关注,因此学者们开始致力于研究如何使癌症患者在癌症治疗后仍能保存生殖内分泌功能。2006年,Chen等通过动物研究,提出一种新型快速冷冻方法,即直接覆盖玻璃化冷冻法(direct cover vitrification, DCV),这种方法能使冷冻速率达到最大,更容易形成玻璃化状态减少冰晶的形成,损伤也更小。卵泡是哺乳动物卵巢内的基本功能单位,它为卵母细胞的生长发育、成熟提供微环境。哺乳动物卵巢皮质层内储存有大量的窦前卵泡,包括始基卵泡、初级卵泡和次级卵泡,它们体积小,数量众多,冷冻过程中不易损伤,适于冷冻保存。探讨其体外培养技术可做为一种研究工具观察卵子的发生及其体内生长调控机制,不仅对人类卵母细胞发育调控有新的认识,对于保存女性生殖能力及濒危物种也有巨大的意义。由于体外模拟体内生长环境进行培养十分困难,因此目前的研究重点主要是窦前卵泡的体外培养。目的本研究使用直接覆盖玻璃化冷冻人卵巢组织后,解冻并分离出窦前卵泡,采用藻酸钙三维培养体系并在培养基中加入不同浓度的激活素A,通过比较培养前后卵泡直径和雌二醇水平的变化以探讨其对人窦前卵泡生长发育的影响,从而为构建人类卵子库建立实验基础。方法研究对象为18例在我院因卵巢良性肿瘤需行手术的患者。将所收集的卵巢组织在体视显微镜下分割成1mm×1mm×1mm的组织块,随机分为新鲜对照组、直接覆盖玻璃化冷冻组(DCV组)。解冻后采用酶消化联合机械分离法分离出单个人窦前卵泡,采用藻酸钙三维培养体系并在培养基中加入不同浓度的激活素A进行体外培养,隔天测量卵泡直径并半量换液,收集培养液置于-20℃冰箱保存,采用电化学发光免疫分析法(electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA)测定雌二醇水平。采用SPSS13.0统计学软件对实验数据进行统计学分析。结果1.将冷冻前后的卵巢组织切片进行HE染色,冻融组形态与新鲜组相似,卵泡形态正常并且各级卵泡分布与新鲜组无明显差异。未观察到卵泡形态的明显改变。冻融前后各级卵泡存活率无明显差异(P>0.05),冷冻后分离出的各级卵泡存活率也无统计学差异。冷冻后得到的各级卵泡与新鲜组相比,颗粒细胞生长良好,经台盼蓝染色1分钟后未着色,表明为存活的卵泡。2.使用不同浓度的藻酸钙凝胶进行三维培养,发现形态正常的卵泡均能在其中进一步生长发育,培养8天后卵泡直径均有显著增加(P<0.05),但卵泡在浓度为0.25%的藻酸钙凝胶中的生长趋势最快,卵泡直径增幅及存活率均高于对照组,差异有显著性(P<0.05),其余两实验组卵泡直径增幅相比,差异无统计学意义(P>0.05)。3.体外培养8天后,对照组及不同浓度藻酸钙三维培养的单个卵泡均能分泌雌二醇(E2,estradiol),藻酸钙各组释放的E2均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；其中卵泡在浓度为0.25%的藻酸钙凝胶中培养释放的E2水平最高,差异有统计学意义(P<0.05)。4.使用0.25%浓度的藻酸钙凝胶分别培养不同直径的卵泡,两组卵泡的存活率无明显差异(P>0.05),但两组卵泡直径的增幅相比,差异有统计学意义(P<0.05)。5.使用浓度为0.25%的藻酸钙凝胶继续培养,并在培养基中添加不同浓度的激活素A(activinA),培养8天后,除1ng/ml组的卵泡直径无明显生长外(P>0.05),其余两组卵泡直径均有显著增长(P<0.05)。体外培养期间,对照组及不同浓度激活素A培养的单个卵泡均能分泌E2,激活素A各组释放的E2高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),其中,培养基中添加100ng/ml的激活素A培养后释放的E2高于10ng/ml组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.直接覆盖玻璃化冷冻法不损伤人卵巢组织中始基、初级卵泡,可用于人卵巢组织的冷冻保存。2.藻酸钙三维培养体系有利于人窦前卵泡的生长,尤其是浓度为0.25%的藻酸钙凝胶。3.直径较大卵泡的生长速度和发育潜能优于直径较小的卵泡。4.体外培养液中添加激活素A有利于人窦前卵泡的生长发育