类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种累及全身系统的常见慢性自身免疫病,临床主要表现为小关节局部肿胀疼痛、功能障碍、伴有全身性轻、中度发热等。RA在世界范围内发病率均较高,但发病机制尚不清楚,也没有理想的根治药物。深入探讨RA发病机制、寻找新的治疗靶点以及开发新型有效药物是目前RA研究的主要热点。已知交感神经兴奋、免疫系统活化,促进成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte,FLS）异常增殖是RA的重要病理过程,FLS是RA的效应细胞,其增殖主要受细胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）浓度调控。有研究报道,高浓度肾上腺素可促进HEK293细胞上β₂肾上腺素受体（β₂ adrenergic receptor,β₂AR）发生偶联Gαs-Gαi转换,导致细胞内cAMP水平降低,细胞功能障碍。而RA患者体内高水平的肾上腺素是否通过引起FLS上β₂AR发生偶联Gαs-Gαi转换,活化Gαi,减少细胞内cAMP产生,引起FLS异常增殖的尚无报道。课题组以往研究发现,芍药苷（paeoniflorin,Pae）可恢复炎性FLS中GPCR活性和Gαs-Gαi平衡,升高细胞中cAMP水平,抑制炎性FLS增殖。以Pae为基础研发的芍药苷-6-氧-苯磺酸酯（CP-25）可有效缓解胶原性关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）,下调佐剂性关节炎（adjuvant-induced arthritis,AA）大鼠脾细胞中增多的G蛋白偶联受体激酶2（G-protein-coupled receptor kinase 2,GRK2）与4型前列腺素E₂受体（Prostaglandin E₂ receptor 4,EP4）的共定位水平。课题组最近发现CP-25可以抑制GRK2 S685位点磷酸化,提示其对GRK2活性具有调节作用。文献报道,在心肌细胞中,β₂AR发生偶联Gαs-Gαi转换可能与蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）或GRK2对受体的磷酸化有关,CP-25是否通过抑制GRK2,调控β₂AR磷酸化,阻止β₂AR偶联Gαs-Gαi转换而改善FLS功能的尚不清楚。目的:阐明β₂AR发生偶联Gαs-Gαi转换参与了CIA大鼠FLS的异常活化;揭示β₂AR偶联Gαs-Gαi转换发生的机制;明确CP-25对FLS功能及β₂AR受体的调节作用及机制。方法:为阐明β₂AR发生偶联Gαs-Gαi转换参与了CIA大鼠FLS的异常活化,分离培养鸡II型胶原诱导的CIA模型FLS,采用CCK-8法检测FLS增殖,Transwell法检测FLS的侵袭和迁移,lipofectamine 2000法转染β₂AR shRNA至FLS中,抑制β₂AR表达后检测FLS增殖,荧光共振能量转移法检测炎性FLS上β₁AR和β₂AR产生cAMP的功能,免疫荧光法检测β₁AR和β₂AR表达以及β₂AR与Gαs或Gαi的偶联情况;为揭示β₂AR偶联Gαs-Gαi转换发生的机制,免疫荧光法检测p-β₂AR^S345/346和p-β₂AR^S355/356表达,帕罗西汀体外给药后检测FLS增殖水平;为明确CP-25对FLS功能及β₂AR受体的调节作用及机制,灌胃给予CIA大鼠CP-25（50mg/kg,qd）或MTX（0.5 mg/kg,三天一次）,给药21天,观察全身表现评分、关节炎指数、关节炎肿胀数和继发侧足爪肿胀度等整体指标,关节病理,胸腺和脾脏指数,T和B淋巴细胞增殖,FLS增殖、侵袭和迁移,ELISA检测血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor,TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）水平和肾上腺素水平,免疫组化法检测滑膜组织β₂AR表达,免疫荧光法检测各给药组FLS中β₂AR与Gαs或Gαi的偶联情况。结果:1.CP-25体外给药对CIA大鼠FLS功能的影响与正常大鼠相比,CIA大鼠体重减轻,全身表现评分、关节炎指数、关节炎肿胀数和继发侧足爪肿胀度均较正常组大鼠显著升高;CIA组FLS增殖、迁移和侵袭能力明显增强,CP-25或MTX体外给药组FLS的增殖、迁移和侵袭能力明显降低。2.CIA大鼠FLSβ₁AR和β₂AR蛋白表达的变化及CP-25对其的影响免疫荧光检测显示,CIA大鼠FLS内β₁AR的表达与正常FLS相比没有明显差异,CIA大鼠FLS的β₂AR表达明显较正常FLS升高,CP-25体外给药可显著减少CIA FLS的β₂AR表达。3.CIA大鼠FLS上βARs功能的改变及CP-25对其的影响ISO（100nM）刺激正常大鼠FLS可产生大量cAMP,使用ICUE3探针可以观察到YFP/CFP比值大幅降低,炎性FLS在ISO刺激下产生cAMP明显减少;β₁AR激动剂多巴酚丁胺（dobutamine,Dob,0.1μM）仍可以刺激CIA FLS产生cAMP,与正常FLS水平接近;β₂AR激动剂特布他林（terbutaline,Ter,1μM）刺激CIA FLS产生cAMP显著减少,提示炎性FLS上β₂AR-cAMP信号发生障碍。CP-25体外给药可以有效地恢复ISO或Ter刺激CIA FLS产生cAMP的能力,对β₁AR产生cAMP没有影响,提示CP-25对β₂AR的功能具有改善作用,恢复FLS内cAMP含量。4.转染β₂AR shRNA对CIA大鼠FLS增殖的影响转染β₂AR shRNA减少FLS中β₂AR表达,可以抑制ISO刺激的CIA FLS增殖,提示β₂AR在CIA大鼠FLS异常增殖中发挥重要作用。5.CIA大鼠FLSβ₂AR与Gαs或Gαi偶联的变化及CP-25对其的影响正常组大鼠FLSβ₂AR与Gαs偶联较多,与Gαi偶联较弱,模型组FLSβ₂AR与Gαs偶联明显减弱,与Gαi偶联显著增多,CP-25体外给药可恢复β₂AR与Gαs偶联,阻止β₂AR与Gαi偶联。6.CIA大鼠FLS p-β₂AR^S345/346和p-β₂AR^S355/356水平的变化及CP-25对其的影响丝氨酸345/346是β₂AR的PKA磷酸化位点,丝氨酸355/356是GRK2磷酸化位点。CIA大鼠FLS p-β₂AR^S345/346表达无明显改变,而p-β₂AR^S355/356表达明显升高,CP-25体外给药可降低FLS p-β₂AR^S355/356表达,对p-β₂AR^S345/346没有明显影响。提示CP-25对GRK2磷酸化β₂AR具有抑制作用。7.帕罗西汀体外给药对CIA大鼠FLS增殖的影响GRK2抑制剂帕罗西汀体外给药可以显著抑制CIA大鼠FLS的异常增殖。8.CP-25对CIA大鼠整体指标的影响CIA模型大鼠体重较正常组减轻,全身表现评分、关节炎指数、关节炎肿胀数和继发侧足爪肿胀度比正常组大鼠显著升高,CP-25灌胃给药可明显改善大鼠CIA的各项整体指标。9.CP-25对CIA大鼠FLS功能的影响CIA组FLS增殖、迁移和侵袭能力明显增强,CP-25体内给药组FLS的增殖、迁移和侵袭能力明显降低。10.CP-25对CIA大鼠踝关节病理的影响CIA组大鼠关节病理H&E染色显示:FLS增生明显、多种免疫细胞浸润、血管扩张、有血管翳形成,CP-25治疗组大鼠的踝关节病理改变明显减轻。11.CP-25对CIA大鼠胸腺脾脏指数的影响CIA组大鼠的脾脏较正常组明显增大,胸腺较正常组大鼠胸腺明显减小,CP-25治疗可以显著升高CIA大鼠胸腺指数,降低脾脏指数。12.CP-25对CIA大鼠血清中TNF-α、IL-1β和肾上腺素水平的影响CIA组大鼠血清中肾上腺素、TNF-α和IL-1β表达水平明显升高,CP-25治疗可显著降低CIA大鼠血清中上述因子表达水平。13.CP-25对CIA大鼠T、B淋巴细胞增殖的影响CIA组大鼠T、B淋巴细胞增殖能力明显增强,CP-25体内给药组大鼠T、B淋巴细胞的增殖能力明显降低。14.CP-25对CIA大鼠滑膜组织中β2AR表达的影响免疫组化结果显示,CIA组大鼠踝关节滑膜组织中β₂AR的表达显著升高,CP-25治疗可显著降低CIA大鼠滑膜组织中β₂AR的表达。15.CP-25对CIA大鼠FLSβ2AR与Gαs或Gαi偶联的影响。正常组大鼠FLSβ₂AR与Gαs偶联较多,与Gαi偶联较弱,模型组FLSβ₂AR与Gαs偶联明显减弱,与Gαi偶联显著增多,CP-25灌胃给药可恢复β₂AR与Gαs偶联,阻止β₂AR与Gαi偶联。结论:1.CIA大鼠FLS中GRK2磷酸化β₂AR的S355/356位点,引起β₂AR发生偶联Gαs-Gαi转换;2.CIA大鼠FLS中β₂AR与Gαi偶联增多,减少细胞内cAMP水平,促进FLS异常活化;3.CP-25通过抑制β₂AR的GRK2位点磷酸化,阻止β₂AR偶联Gαs-Gαi转换,恢复细胞内cAMP水平,发挥抑制CIA大鼠FLS活化的作用,有效地改善大鼠CIA。