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实验目的:mTORC1信号被证明能够通过刺激软骨细胞中蛋白的合成来促进骨骼的生长发育。然而,mTORC1信号在前软骨间充质细胞中的潜在作用仍未被探索。本实验我们通过对Raptor基因敲除的小鼠及正常小鼠胚胎的肢芽间充质细胞进行对比,观察Raptor基因敲除对小鼠胚胎肢芽发育的影响。同时行体外细胞实验,通过药理学及遗传方法抑制mTOR通路来探究该通路对细胞增殖、软骨结节的形成及相关基因表达的影响。实验方法:1.用mTORC1通路抑制剂雷帕霉素处理小鼠软骨祖细胞,行Western实验以验证小鼠软骨祖细胞中mTORC1通路是否激活以及雷帕霉素对该通路是否有抑制作用;计数雷帕霉素处理一天及两天后的细胞数量,并与对照组对比。2.取孕11.5天左右的Raptor基因敲除小鼠及对照组正常小鼠胚胎的肢芽行对比研究,分别行流式细胞分析,显微镜下摄像,整体原位杂交,原代细胞成软骨培养,亚甲蓝染色等实验方法来探究二者之间的区别。3.诱导小鼠软骨祖细胞成软骨,实验组在诱导成软骨的同时加入mTORC1通路抑制剂雷帕霉素,比较实验组与对照组亚甲蓝染色及基因表达量的区别。实验结果:在这项研究中,我们首先使用mTORC1通路抑制剂雷帕霉素处理小鼠软骨祖细胞,行Western分析发现磷酸化的S6蛋白表达受抑制,这表明小鼠软骨祖细胞中mTORC1通路被激活以及雷帕霉素可有效抑制该通路。接下来我们删除肢体前成软骨间充质细胞里的mTORC1信号的一个独立及必要的成分Raptor,Raptor的删除使得肢芽细胞较对照减小,导致在不影响骨骼形状情况下的整个肢芽的缩小。下一步,我们研究了mTORC1信号在小鼠胚胎成软骨分化中的潜在作用。药理学和遗传方法对mTORC1信号通路的干扰显著抑制了肢芽内间充质细胞微团中软骨结节的大小和数量。相似的,抑制小鼠软骨祖细胞中mTORC1的信号显著影响了细胞增殖、软骨结节的形成以及降低了调控软骨细胞分化的关键调控转录基因SOX9,软骨基质基因Acan和Col2al的表达。实验结论:我们证明了mTORC1信号在促进肢芽间充质细胞的生长及其成软骨分化中的作用。