第一部分线粒体应激对卵子体外成熟、纺锤体形态、端粒长度及DNA双链断裂损伤的影响目的:研究线粒体应激对人GV期卵子体外成熟、纺锤体形态、端粒长度以及DNA双链断裂损伤的影响。方法:收集58名IVF/ICSI患者的共172个GV期卵子,将其随机分为线粒体应激组(在含750nMFCCP的培养基中培养1小时)和对照组。对两组卵子进行体外培养直至第·极体排出。观察比较两组卵子的体外成熟率、纺锤体形态及结构的差异。对持续性分裂末期卵子的染色质和纺锤体进行免疫荧光染色,观察由端粒融合所致的染色质桥的形成。使用SCATR-PCR的方法对两组成熟卵子极体的单细胞平均端粒长度进行测定,并使用SC-STELA的方法对部分成熟卵子的最短端粒长度进行测定。使用免疫荧光染色的方法对两组卵子的DNA双链断裂损伤程度进行定量分析。结果:GV期卵子体外培养了 24小时之内,总共约有55%的卵子体外成熟。其中,线粒体应激组MII期成熟卵子的比例少于对照组(47%vs 62%,P=0.068)。考虑到年龄为影响卵子线粒体功能的主要混杂因素,因此我们按照年龄将患者分为年轻组(23-35岁)、年长组(36-41岁),在年轻患者的卵子中,体外培养24小时之内线粒体应激组卵子发育成熟的比例显著低于对照组卵子(49%vs 74%,P=0.013),差异具有统计学意义。在年长患者的卵子中,体外培养24小时内的线粒体应激组的卵子发育成熟比例与对照组卵子发育成熟比例并无显著统计学差异(47%vs49%,P=0.900)。使用极化偏振光学显微镜观察两组卵子的纺锤体结构形态。线粒体应激组与对照组相比,“可见纺锤体”的卵子比例显著少于对照组,“未见纺锤体”和“异常纺锤体”的卵子比例显著多于对照组,差异有统计学意义(P=0.001)。对所有“可见纺锤体”的卵子进行参数分析,线粒体应激组卵子与对照组卵子在纺锤体的双折射信号延迟度以及纺锤体面积上并无统计学差异。即使使用年龄分层进行分析,两组在这两项指标中仍无显著性差异。通过对所有疑似发生端粒融合的卵子的持续性分裂末期纺锤体进行染色,我们并未发现染色质桥的形成。通过对单个卵子极体细胞平均端粒长度的测定和对单个卵子最短端粒长度的测定,线粒体应激组患者卵子的平均端粒(P=0.001)和最短端粒(P=0.09)均短于对照组。有意思的是,线粒体应激对年轻患者卵子端粒长度的影响大于年长患者。并未发现两组成熟卵子的DNA双链断裂损伤定量有显著性差异(P=0.81)。结论:GV期卵子接受线粒体应激后会影响卵子的体外成熟和正常形态纺锤体的形成,并可以导致卵子成熟后的端粒长度短于对照组。线粒体应激对卵子的这种影响在年轻患者的卵子中比在年老患者的卵子中体现的更加明显。并没有发现GV期的短期线粒体应激可对卵子DNA双链断裂损伤反应造成显著影响。第二部分 线粒体应激对MⅡ期成熟卵子孤雌激活、胚胎早期发育、胚胎端粒长度及DNA双链断裂损伤的影响目的:研究线粒体应激对MⅡ期成熟卵子孤雌激活、胚胎早期发育、胚胎端粒长度及胚胎细胞DNA双链断裂损伤的影响。方法:使用极化偏振光学显微镜对小鼠MⅡ期成熟卵子接受线粒体应激处理后的纺锤体形态结构进行活体成像,动态观察线粒体应激对小鼠卵子减数分裂纺锤体形态结构的影响。将小鼠MⅡ期成熟卵子随机分为对照组和线粒体应激组。将线粒体应激组的卵子放置于含有750nM FCCP的KSOM培养基中处理90分钟,立即将其转移至常规KSOM培养基中直至肉眼可见纺锤体恢复一定的形态结构之后,将对照组和线粒体应激组卵子同时孤雌激活,观察卵子时期经受线粒体应激对其孤雌激活率、胚胎早期分裂的影响。使用SCATR-PCR的方法测量两组胚胎端粒长度。使用DNA损伤标记物γ-H2AX与端粒相关蛋白TRF-1免疫荧光共染色的方法观察卵子时期接受线粒体应激对胚胎细胞DNA双链断裂损伤的影响以及损伤定位与端粒之间的关系。结果:卵细胞纺锤体对线粒体应激十分敏感,线粒体应激处理仅两分钟后即可观察到纺锤体的双折射信号延迟度开始减弱,纺锤体的面积也开始减小。大约7-8分钟后几乎肉眼无法分辨纺锤体的清晰结构。对照组卵子的孤雌激活成功率显著高于线粒体应激组卵子(P<0.05),线粒体应激组卵子在孤雌激活形成孤雌胚胎后,可出现细胞分裂不均匀的现象。对早期分裂胚胎的端粒长度进行测量发现,线粒体应激组的胚胎端粒长度显著短于对照组(P<0.05),而直接对小鼠MⅡ期卵子的端粒长度进行测量时发现,对照组和线粒体应激组卵子的端粒长度并无显著性差异(P>0.05)。在对两组胚胎DNA损伤表现的比较中我们发现,对照组孤雌胚胎细胞核内γ-H2AX数量显著低于线粒体应激组孤雌胚胎(P<0.01),即线粒体应激组存在着更多的DNA双链断裂损伤。但是通过计数γ-H2AX与TRF-1共染色信号,并未发现线粒体应激组有更多的双链断裂损伤发生在端粒DNA的区域(P>0.05)。结论:MⅡ期卵子时期接受线粒体应激可通过损伤纺锤体而地影响卵子的激活,影响胚胎细胞的早期均衡分裂,并可导致胚胎细胞中的端粒较短,且DNA双链断裂损伤增加。我们推测,卵子时期线粒体应激对胚胎早期发育端粒长度的影响可能是通过影响胚胎早期端粒替代延长途径(ALT)机制的激活与效率而实现的。第三部分 青春期摄入甲基苯丙胺对小鼠性成熟后卵巢储备及生育功能的影响目的:研究青春期摄入甲基苯丙胺对小鼠性成熟后卵巢储备和后代发育所产生的影响。方法:将小鼠随机分为实验组和对照组,实验组小鼠腹腔注射中等剂量的甲基苯丙胺(5毫克/千克体重),对照组小鼠腹腔注射同等体积的0.9%生理盐水。从产后21天开始,每周连续注射三天,休息四天,按照上述规律连续注射8周。之后采用透射式电子显微镜观察小鼠卵巢中颗粒细胞线粒体形态,并使用蛋白免疫印记的方法检测卵巢组织中线粒体相关凋亡途径蛋白(BAX,Bcl-2)的表达及卵巢储备功能相关蛋白通路(AMH,AMHR2)的表达水平。将卵巢组织切片,观察并计数两组小鼠卵巢切面的始基卵泡、生长卵泡及闭锁卵泡。连续注射8周后停药2周,之后检测两组小鼠的动情周期变化、性交活动能力、产仔率以及出生体重的差异。结果:青春期长期摄入甲基苯丙胺的小鼠卵巢颗粒细胞与对照组小鼠卵巢颗粒细胞相比,表现出明显的线粒体肿胀、变性,以及线粒体嵴间隔的明显增宽。通过对线粒体相关凋亡途通路蛋白的检测,我们发现甲基苯丙胺组小鼠卵巢中致凋亡因子BAX的表达量显著增高(P<0.0 1),而抗凋亡因子Bcl-2的表达量比对照组显著降低(P<0.01)。卵巢切片卵泡计数的结果显示,甲基苯丙胺组小鼠卵巢中始基卵泡和生长卵泡的数量显著低于对照组(P<0.01),而闭锁卵泡的数量则相对增多(P<0.05),同样的,甲基苯丙胺组小鼠卵巢组织中AMH的表达量也低于对照组(P<0.05)。在停药2周之后,检测两组小鼠的动情周期和性行为能力,发现两组在动情周期和性行为能力上无显著差异(P>0.05)。两组小鼠在每窝产仔量和幼崽出生体重方面也无显著的统计学差异(P>0.05)。结论:青春期摄入甲基苯丙胺可对小鼠卵巢储备功能产生不良影响。但停药一段时间后,药物损伤不会直接影响小鼠的动情周期、性行为能力、产仔率及后代出生体重。