普鲁兰(Pullulan)是一种由麦芽三糖经α-1,6糖苷键聚合而成的微生物多糖,一般由多形态真菌出芽短梗霉发酵产生。普鲁兰独特的线性结构使其具有典型的成膜性、粘合性、阻氧性和可生物降解等生理特性,因此,在食品、化工、医药和环保等行业具有广阔的应用前景。与以往发酵法生产普鲁兰的方法不同,本论文采用全细胞转化法合成普鲁兰。以出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans CCTCC M 2012259)为出发菌株,探讨该菌株在转化葡萄糖合成普鲁兰的可行性,优化种子培养基以提高细胞合成普鲁兰的能力,研究表面活性剂在促进普鲁兰生物合成中的作用,考察金属离子对普鲁兰生物转化的影响及其机制。主要研究内容和结果如下:1.采用响应面法优化种子培养基,以提升A.pullulans CCTCC M 2012259细胞转化葡萄糖合成普鲁兰的能力。首先,采用单因素实验考察种子培养基中各营养组分对普鲁兰转化能力的影响。在此基础上,运用Plackett-Berman设计筛选出影响普鲁兰转化能力最为显著的三种营养物:葡萄糖、酵母粉和七水硫酸镁。利用响应面分析对这这三种营养物的浓度进行优化,得到最佳的种子培养基成分组合:葡萄糖63.97 g/l,酵母粉3.57 g/l,硫酸铵0.6 g/l,磷酸氢二钾5.0 g/l,氯化钠1.0 g/l,七水硫酸镁0.18 g/l。验证实验结果表明,在优化培养基中获得的细胞,其转化葡萄糖合成普鲁兰的能力为32.72 mg/g/h,比原始培养基提高了23.1%。同时,转化过程中葡萄糖的消耗速率和普鲁兰的合成速率都比对照更快,说明应用响应面分析优化种子培养基是可行的。此外,对A.pullulans CCTCC M 2012259细胞中普鲁兰合成关键酶基因的表达水平和酶活大小进行测定,结果发现,pgm1和fks基因的转录水平分别比对照组的上调了2.5倍和1.2倍,PGM和FKS的酶活性也分别提高了17%和19%,解释了种子培养基优化提高了普鲁兰转化能力的原因。最后,对全细胞转化法和发酵法合成普鲁兰的培养基成分进行成本核算,全细胞转化法要比发酵法节省22.12%。2.考察了不同类型表面活性剂在普鲁兰生物转化中的作用,发现吐温和斯潘在普鲁兰生物转化中具有显著的促进作用。在此基础上,摇瓶转化结果表明Tween80和Span 80在普鲁兰生物转化中具有十分突出的作用,当二者浓度分别为5 g/l和20 g/l时,普鲁兰产量分别比对照提高了36.10%和38.39%。Tween 80和Span 80复配进一步提高了普鲁兰的合成量,但并没有累加效应。研究了表面活性剂提高普鲁兰生物转化效率的作用机制,发现Tween 80和Span 80对细胞存活率没有显著影响,但提高了细胞内膜的通透性,有效调控了普鲁兰生物合成途径中三种关键酶的酶活,并且增加了胞内能量物质ATP的供给,因而显著提高了全细胞合成普鲁兰的产量。3.考察了不同种类的金属离子在普鲁兰生物转化中的作用,结果发现铜离子可以显著促进普鲁兰生物转化。分别向转化液和种子培养基中添加铜离子,考察其对普鲁兰转化的影响,结果发现,最适的铜离子添加浓度均为0.2 mg/l,普鲁兰产量分别比对照(转化液和种子培养基中均未添加铜离子)提高了36.2%和42.3%。在此基础上,考察了同时向转化液和种子培养基中添加铜离子时普鲁兰生物转化的情况,结果发现转化至48 h时,普鲁兰产量比对照提高了52%,表明在这两个过程中铜离子的添加具有协同作用,但没有累加效应。最后,研究了铜离子促进普鲁兰生物转化的作用机制,发现适量的铜离子既不会影响细胞的存活率,也不会导致黑色素的产生,而是提高了普鲁兰合成途径中关键酶的活性,增加了胞内ATP的含量,并最终提高了普鲁兰生物转化的产量。