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苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,以下简称Bt）是革兰氏阳性细菌,由于其在生长代谢过程中会产生对许多靶标害虫具有特异杀虫活性且对环境友好、对人畜无害的杀虫蛋白。已成为在世界范围内应用最为广泛的微生物杀虫剂之一。近年来,随着Bt制剂的用量逐年增大和转Bt基因植物种植面积的扩大,害虫种群对Bt杀虫蛋白产生抗性的问题也愈发严重。同时,Bt杀虫剂杀虫范围有限,持效时间短以及易受温度、紫外线等环境影响的问题也逐渐暴露出来。因此优良Bt菌株的分离筛选和Bt新型基因的发掘具有重要的研究价值和实际应用意义。本研究从辽宁省不同地区的山丘、农田和城市侵蚀地共采集524份土样,从中分离出66株野生菌株,伴胞晶体形状有球形、椭圆形、短双锥形、菱形以及不规则形等。利用PCR-RFLP方法对分离株的基因型进行鉴定,在分离株中检测出cry1Ac、cry2Aa、cry8E、cry8F四种基因型。单菌株中基因的组合类型也较为丰富,包括cry1Ac+cry8E、cry2Aa+cry8E及cry1Ac+cry2Aa+cry8E等,充分体现了辽宁省Bt资源的多样性。提取Bt分离株总蛋白,对鳞翅目害虫棉铃虫、小菜蛾、斜纹夜蛾、玉米螟以及粘虫进行生物活性分析,筛选出有较高杀虫活性的菌株有DD214-2、DD229、YK524及YK540。对实验室保存的、研究更为深入的Bt菌株LTS290进行基因组测序,经序列比对发现该菌株基因组中可能含有cry类新基因。设计全长引物对其进行扩增,从菌株LTS290中成功克隆出新型cry基因,基因全长2187 bp,编码729个氨基酸残基,与已知的Cry19Bb1蛋白的相似性为42%,属于第一等级新基因。将全长序列提交GenBank,登录号为MK131319,经国际δ-内毒素命名委员会正式命名为cry79Aa1。将cry79Aa1基因连接到表达载体pET-21b,将筛选得到的阳性克隆转入到大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达,经SDS-PAGE分析,得到了约85 kDa的目的蛋白带,与预期一致。将表达的蛋白命名为pET-79Aa。将表达的蛋白进行鳞翅目昆虫大豆食心虫、棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的杀虫活性测定分析。结果显示,pET-79Aa蛋白对大豆食心虫无明显杀虫活性,但有体重抑制现象。对甜菜夜蛾、棉铃虫和小菜蛾有一定的杀虫活性,LC50分别为26.037μg/ml、37.579μg/ml和34.582μg/ml。对实验室保存的、研究更为深入的Bt菌株BJH500进行PCR-RFLP分析,发现该菌株基因组中可能含有cry8类新基因,设计全长引物对其进行扩增。从菌株BJH500中成功克隆出cry8Ca、cry8Ea基因,其中cry8Ca基因属于第四等级新基因。将全长序列提交GenBank,登录号为MK167020,经国际δ-内毒素命名委员会正式命名为cry8Ca5。将cry8Ca、cry8Ea基因连接到表达载体pET-21b,将筛选得到的阳性克隆转入到大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达,经SDS-PAGE分析,均得到了约130 kDa的目的蛋白带,与预期一致。将表达的蛋白分别命名为pET-8Ca、pET-8Ea。将表达的蛋白进行鳞翅目昆虫大豆食心虫、棉铃虫、小菜蛾以及甜菜夜蛾的杀虫活性测定分析。结果显示,两种蛋白对棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾几乎没有杀虫活性。对大豆食心虫无明显杀虫活性,但存在一定的体重抑制现象。