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褪黑素是一种由松果体分泌的多效激素,研究证实其功能的多样性可促进骨骼肌的再生与修复,例如抗炎症作用、抗凋亡作用和抗氧化应激作用。然而,褪黑素对肌生成的负面作用却鲜有报道。因此本研究设计试验探究了不同浓度褪黑素对小鼠成肌细胞增殖、分化和凋亡的影响;进一步通过高通量测序,探究褪黑素抑制肌肉发育的作用机制。研究的具体内容和结果如下:1不同浓度褪黑素对小鼠成肌细胞增殖、分化和凋亡的影响本研究主要以C2C12细胞为研究对象,探究了不同浓度褪黑素（0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1和2mM）对成肌细胞增殖、分化和凋亡的影响。在增殖方面,l mM褪黑素在48-96h之内可显著促进C2C12细胞增殖（48h,P<0.05;72h,P<0.01;96h,P<0.01）。2mM褪黑素在0-24h之内对C2C12细胞增殖没有显著影响,但在48-96h之内抑制了 C2C12细胞增殖并导致细胞出现死亡（48h,P<0.05;72h,<0.01;96h,P<0.001）。结晶紫染色结果表明,与对照组相比,1 mM褪黑素处理48h致使C2C12细胞密度增加了 20%。实时荧光定量PCR结果表明,与对照组相比,1 mM褪黑素处理48h显著提高了 Ki67mRNA水平。免疫荧光染色结果显示,与对照组相比,1 mM褪黑素处理48h显著提升了 Ki67阳性细胞的比例。在分化方面,0-0.5mM褪黑素处理4天对C2C12细胞分化没有显著影响,而1、2mM褪黑素处理却显著的抑制了 C2C12细胞分化,降低了成肌分化标志基因 Myogenin（1 mM 和 2 mM,P<0.001）,eMyhc（1 mM 和 2 mM,P<0.001）和肌融合标志基因 Cadh-15（2mM,P<0.01）,Capn-1（2mM,P<0.01）,Cav3（0.05-0.5 mM,P<0.05;1 和 2mM,P<0.001）以及 Des（1 mM,P<0.05和2 mM,P<0.01）的mRNA水平。在凋亡方面,流式分析结果显示,与对照组相比,1 mM褪黑素处理没有产生明显的凋亡现象,而2mM褪黑素处理则显著诱导C2C12细胞产生凋亡。2褪黑素处理显著抑制小鼠C2C12成肌细胞和小鼠原代成肌细胞的分化通过采用不同浓度褪黑素处理C2C12细胞,我们发现1 mM褪黑素可以促进C2C12细胞增殖,但却抑制其分化。在此基础上,本研究进一步表明,1 mM褪黑素可抑制C2C12成肌细胞和小鼠原代成肌细胞的分化效率,阻碍其肌管形成。免疫荧光染色（MyHC）结果均显示C2C12成肌细胞和小鼠原代细胞的肌管形成受到到显著抑制,肌管核数与对照组相比明显减少。免疫荧光染色（MyoG）和统计分析结果表明褪黑素处理组中C2C12成肌细胞中MyoG阳性细胞的比例相比于对照组显著减少。实时荧光定量PCR结果显示褪黑素处理的C2C12成肌细胞中分化和融合相关基因的MyoG,eMyhc,Cav3,Des的mRNA水平与对照组相比显著减少,而MyoD和Myh8无显著性差异。蛋白印迹结果显示褪黑素处理的C2C12成肌细胞中分化标志基因MyoG,MyHC的蛋白水平与对照组相比显著减少,而MyoD的蛋白水平无显著性差异。3褪黑素处理显著下调了小鼠C2C12成肌细胞肌融合特异性基因Myomaker和Myomixer-myomerger-minion 的表达为了探究褪黑素抑制小鼠成肌细胞分化的机制,我们对褪黑素处理的C2C12成肌细胞和对照组进行高通量测序。结果表明,与对照组相比,褪黑素处理的C2C12细胞中共有364个基因上调,774个基因下调。Go富集分析表明,超过40%的差异基因属于生物学过程大类,而另外两大类（细胞组分和分子功能）基因由79%细胞内组分,64%细胞膜组分和59%蛋白结合组分构成。基因热图显示,与对照组相比,褪黑素处理的C2C12细胞中肌球蛋白重链家族基因显著下降。而且在差异性基因表达谱中,有两种最新报道的肌融合特异性基因Myomaker（Tmem8c）和 Myomixer-myomerger-minion（Gm7325）也发生了显著下降。另外,也有一些Wnt信号通路相关基因发生了两倍以上的变化:Fzdl,Sfrp2,Wisp2,Prkca,Camk2a 和 Porcn。4褪黑素通过磷酸化GSK-3b丝氨酸9号位点调控C2C12细胞成肌分化以及 Myomaker 和 Myomixer-myomerger-minion 的表达研究表明,与对照组相比,褪黑素处理可显著降低pGSK-3b,b-catenin的蛋白表达量。免疫荧光染色（b-catenin）结果表明褪黑素处理组中C2C12成肌细胞中b-catenin表达量相比于对照组显著减少。为了进一步验证褪黑素通过GSK-3b调控小鼠成肌细胞分化,我们采用GSK-3b抑制剂LiCL作用于褪黑素处理的C2C12细胞。结果表明,与对照组（NaCL）相比,对照组（LiCL）C2C12成肌细胞的分化效率、分化和融合相关基因MyoG,Myh8,eMyhc,Cav3,Des,Myomaker,Myomixer 的 mRNA 水平,MyHC,MyoG,pGSK-3b,b-catenin,Myomaker和Myomixer的蛋白表达水平均显著升高。与褪黑素组（NaCL）相比,褪黑素组（LiCL）C2C12成肌细胞的分化效率,分化和融合相关基因MyoG,Myh8,eMyhc,Cav3,Des 的 mRNA 水平,MyHC,MyoG,pGSK-3b,b-catenin的蛋白表达水平均得到了一定程度的恢复。有趣的是,与褪黑素组（NaCL）相比,褪黑素组（LiCL）C2C12成肌细胞的融合特异性基因Myomaker的mRNA水平、蛋白表达水平得到了一定程度的恢复,但Myomixer的mRNA水平、蛋白表达水平却没有恢复。总的来说,我们发现褪黑素可抑制成肌分化,下调成肌分化标志基因MyoG、MyHC 和肌融合特异性基因 Myomaker、Myomixer-Myomerger-Minion 的表达。此外,我们证实了褪黑素是通过Wnt/b-catenin信号通路来调控Myomaker和Myomixer的表达。