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农作物暴露在细菌、真菌和病毒等病原微生物环境中,极易受到病虫害的侵害。保护地内温暖湿润的环境导致设施栽培作物病害尤为严重。番茄灰霉病作为一种典型的真菌病害给番茄的产量及质量造成了严重的危害。目前,生产上高度依赖化学杀菌剂,给生态环境和食品安全造成严重威胁。通过基因编辑技术CRISPR/Cas9可以实现灰霉病的精准调控以及抗灰霉病种质创新。因此,迫切需要探究作物防御灰霉病的内在机制。蛋白质泛素化是真核生物重要的翻译后修饰方式之一,在多种信号转导途径中发挥作用。近年来的研究表明,泛素化广泛地参与植物免疫防御调节。PUB(Plant U-box)家族是一类含有U-box结构域的E3泛素连接酶(Ubiquitin-ligating enzyme,E3),可以通过一系列泛素化修饰的级联反应,作为关键元件参与免疫防御。本文通过对番茄PUB基因家族生物信息学分析,进一步筛选出负调控灰霉病抗性的番茄PUB基因家族成员,对于明确植物防御灰霉病的内在机制具有重要意义。主要研究成果如下:1.番茄PUB基因家族生物信息学分析。通过与拟南芥PUB基因家族成员氨基酸序列进行比对,找到番茄中共含有U-box结构域的61个PUB编码基因。除了保守U-box结构域外,还存在ARM(Armadillo)重复序列,激酶等其他结构域。根据结构域的不同,将61个番茄PUB基因分成七大类。其中,数量最多的是含有ARM重复结构的第II类,共30个。ARM重复结构通过蛋白互作从而调控信号转导,所以我们推测番茄PUB第II类基因在植物免疫防御功能中具有重要意义。2.筛选出负调控灰霉病抗性的番茄PUB家族成员。通过上一章对番茄PUB基因家族进行生物信息学分析,推测番茄PUB第II类基因在植物免疫调控中具有重要意义。通过对番茄PUB家族第II类基因进行荧光定量PCR(Quantitive Real-Time PCR,qRT-PCR)分析,初步筛选出对灰霉病响应明显下调的8个基因PCB15/24/25/29/33/41/43/56。通过烟草瞬时过表达加接种灰霉病菌的实验以及共注射过表达PUBs与灰霉分泌蛋白XYG农杆菌菌液的方式,进一步筛选出负调控番茄灰霉病抗性的番茄PUB家族成员PUB33、PUB41、PUB43以及PUB56。将筛选出的基因进行病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)。实验结果表明,沉默PUB33、PUB41、PUB43以及PUB56之后,植株对于灰霉病的抗性提高。通过CRISPR/Cas9技术成功构建PUB41突变体材料,pub41对灰霉病的抗性也明显提高,表明这些基因对于番茄防御灰霉病具有重要意义。3.初步探究了番茄PUB基因负调控番茄灰霉病抗性的机理。上一章已经筛选出负调控番茄灰霉病抗性的番茄PUB家族成员。已有文章表明,PSKR1以及TPK1b是番茄防御灰霉病的关键因子。用CRISPR/Cas9技术获得PSKR1以及TPK1b的突变体材料,接种灰霉病菌后发现,pskr1以及tpk1b与对照植株相比对灰霉病的抗性下降,说明PSKR1以及TPK1b正调控番茄灰霉病抗性。除此之外,我们还发现PUB33定位于细胞膜上,PUB43以及PUB56定位于细胞膜及细胞质内。并且PUB43以及PUB56具有E3泛素连接酶功能。通过双分子荧光互补(Biomolecular fluorescence complementation,BIFC)实验证明 PUB43 与 PSKR1以及TPK1b之间存在互作。初步认为PUB43可能通过泛素化降解PSKR1以及TPK1b,从而引起下游信号传递。