真菌感染严重危害人类健康,尤其在HIV、干细胞移植、肿瘤化疗和原发性免疫缺陷患者中。真菌入侵机体后,巨噬细胞或者树突状细胞（dendritic cells,DC）表面的C型凝集素受体（C-type lectinreceptor,CLR）通过感知真菌细胞壁的各种成分,启动机体免疫应答,招募并促进脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase,SYK）发生转位和活化,从而活化CLR信号通路,最终产生炎性细胞因子和趋化性细胞因子。这些细胞因子进而促进T细胞分化,启动适应性免疫共同参与宿主抵御真菌感染。作为CLR通路重要的接头分子和激酶,SYK的膜转位和活化在抗真菌感染方面至关重要,但对其调控的机制报道较少,除了磷酸化的SYK可以被泛素化降解外,是否还有其他泛素化修饰通过调节SYK从而调控抗真菌免疫反应仍然未知。通过对E3泛素连接酶中的TRIM家族部分成员进行筛选,发现TRIM31是调节SYK活性的关键分子,对其第375和517位赖氨酸进行K27位的泛素化修饰,促进其转位到细胞膜并与Dectin-1或者接头分子Fc受体γ链（Fc receptor-γ,FcRγ）结合,同时抑制磷酸酶SHP-1与其发生相互作用,最终促进SYK的活化。感染白色念珠菌（Candida albicans,Calbicans）后,缺失TRIM31的骨髓来源的树突状细胞（bone marrow derived DC,BMDC）和巨噬细胞（bone marrow derived macrophage,BMDM）中SYK介导的CLR通路信号转导减弱,并减少了炎性细胞因子和趋化性细胞因子的产生。TRIM31的缺失致使上述固有免疫细胞对C.albicans的吞噬能力减弱,产生较少的ROS和NO去杀伤真菌。与野生型小鼠相比,TRIM31缺陷小鼠更易感C.albicans,且T细胞向Th1和Th17分化减少。本研究明确了 TRIM31在抗真菌免疫中的重要作用,丰富了 SYK活化的调节机制,为临床治疗真菌相关疾病提供了新的思路。一、研究目的1.筛选特异性调控SYK的E3泛素连接酶;2.明确TRIM31在抗真菌免疫反应中的作用,探究其作用机制;3.白色念珠菌感染疾病模型确定TRIM31调控抗真菌免疫反应的生理意义。二、研究方法1.筛选调控SYK的E3泛素连接酶将SYK、Ubiquitin（Ub）和TRIM家族的一些重要成员转染入HEK293T细胞,使用免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）的方法富集SYK,蛋白印迹（western blot,WB）检测SYK的泛素化水平,筛选调控SYK的E3泛素连接酶。2.检测TRIM31与SYK的相互结合作用2.1外源结合将 CLR 信号通路中 SYK、SHP-2、PKCδ、CARD9、PLCγ2 和 BCL10 的过表达载体与GFP-TRIM31过表达载体共转染入HEK293T,使用IP和WB检测与TRIM31相互作用的分子。2.2内源结合获取小鼠的BMDC,分别用Zymd或者α-mannan刺激各时间点,使用TRIM31的抗体进行IP,WB检测内源TRIM31与SYK的结合。2.3体外结合将体外翻译得到的TRIM31和SYK重组蛋白共同孵育后,使用TRIM31抗体进行IP,WB检测两者的直接结合作用。2.4截短体结合构建Myc-SYK的截短突变体与GFP-TRIM31共同转染入HEK293T,使用Myc抗体进行IP,WB检测与TRIM31结合的截短体区域。2.5荧光共定位将mCherry-SYK和GFP-TRIM31共同转染入HEK293T,24 h后,使用共聚焦显微镜直接观察两者的共定位情况。3.检测TRIM31对SYK的泛素化修饰作用3.1外源泛素化将 Myc-SYK 或者 Myc-MAVS、HA-Ub、Flag-TRIM31 或者 Flag-TRIM31（C53A,C56A）转染入 HEK293T,使用 Myc 抗体 IP SYK,WB 检测 TRIM31对 SYK 的泛素化修饰。同时也将 Flag-CARD9、Flag-BCL10、Flag-PLCγ2、Myc-SHP-2 和 Myc-PKCδ 的过表达载体和 HA-Ub、Flag-TRIM3 1 或者 Myc-TRIM31转染入HEK293T,使用Flag或者Myc抗体IP相应分子,WB检测以上分子的泛素化水平。将 Myc-Dectin-1、Myc-Dectin-2、Myc-Dectin-3、Myc-Mincle 或者接头分子Myc-FcRγ和HA-Ub、Flag-TRIM31转染入HEK293T,使用Myc抗体IP以上受体或者接头分子,WB检测以上分子的泛素化水平。3.2泛素化类型将Flag-SYK、Myc-TRIM31以及不同位点突变的泛素过表达载体HA-Ub（WT、K6、K11、K27、K29、K33、K48 或 K63）共同转染入 HEK293T,用 Flag抗体做IP,WB检测SYK的泛素化水平以及泛素化类型。3.3内源泛素化分别取Trim31+/+和Trim31-/-小鼠的BMDC,用Zymd或者α-mannan刺激后使用SYK的抗体做IP,WB检测内源SYK的总泛素化以及不同类型泛素化水平。3.4泛素化位点将Flag-SYK、Myc-TRIM31和HA-Ub过表达载体转染入HEK293T。质谱分析（mass spectrometry,MS）检测TRIM31对SYK的泛素化修饰位点。构建相应的Flag标签的SYK赖氨酸位点突变为精氨酸的过表达载体,分别与Myc-TRIM31 和 HA-Ub（K27）共同转染入 HEK293T,使用 Flag 抗体 IP SYK 后,WB明确TRIM31催化SYK的赖氨酸位点。4.探究TRIM31在白色念珠菌感染的动物模型中的生理意义分别取8周龄的Trim31+/+和Trim31-/-雄鼠,尾静脉注射C.albicans（2×105个/只）,每日观测小鼠的体重变化和计算生存率;取感染5 d小鼠的肾脏、脾脏和肺检测真菌滴度;将肾脏组织做病理切片后,分别使用HE、PAS和Ly-6G+染色并作出炎症评分;ELISA检测肾脏和肝脏组织上清中的IL-6和TNF-α的分泌量;取感染5 d小鼠的血清,ELISA检测血清中IgG的分泌量。取感染5 d小鼠的肾脏和脾脏,获取脾细胞后,用加热致死的酵母态白色念珠菌（heat-killed C.albicans yeast,HKCA-Y）刺激 2d,ELISA 检测细胞上清中IFN-γ和IL-17A的分泌量,流式检测Th1和Th17细胞的比例;RT-PCR检测肾脏组织中Ifng、Il17a或/Il17f的mRNA表达水平。分别取8周龄的Trim31+/+和Trim31-/-雄鼠,尾静脉注射C.albicans（1×106个/只）,24 h后眼球取血获得血清,ELISA检测血清中IL-6、TNF-α、IL-12、CXCL1和CXCL2的分泌量。将8周龄的Trim31+/+和Trim31-/-雄鼠的骨髓细胞取出,尾静脉注射回输到X射线辐照过的Trim31+/+的小鼠体内,构建骨髓嵌合小鼠,尾静脉注射C.albicans（2×105个/只）,每日观测小鼠的体重变化和生存率。5.检测TRIM31在细胞水平的抗真菌能力5.1检测TRIM31调控CLR通路诱导的细胞因子分泌取Trim31+/+和Trim31-/-小鼠的 BMDC 和 BMDM,用 Zymd、α-mannan、TDB、HKCA-Y和加热致死的菌丝态白色念珠菌（heat-killed C.albicans hyphae,HKCA-H）刺激细胞,ELISA 检测炎性细胞因子 IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-23和趋化性细胞因子CXCL1和CXCL2分泌水平的变化。5.2基因回补实验检测TRIM31影响CLR通路诱导的细胞因子分泌取Trim31-/-小鼠的BMDC或者BMDM,慢病毒分别回补TRIM31和酶活突变体mTRIM31（C52A,C55A）,用Zymd或α-mannan刺激细胞后,WB检测回补蛋白的表达,ELISA检测IL-6、TNF-α分泌水平的变化。5.3检测TRIM31对细胞吞噬真菌能力的影响取Trim31+/+和 Trim31-/-小鼠的 BMDC 和 BMDM,用 FITC 包被C.albicans后,和以上细胞共同孵育各时间点,台盼蓝淬灭胞外荧光,流式检测细胞对C.albicans的吞噬率。5.4检测真菌诱导的ROS的产生取Trim31+/+和Trim31-/-小鼠的 BMDC 和 BMDM,用 Zymd、α-mannan、TDB、HKCA-Y和HKCA-H刺激后,流式检测细胞内总的ROS的产生。5.5检测真菌诱导的NO的产生分别取Trim31+/+和Trim31-/-小鼠的BMDC和BMDM,用HKCA-Y和HKCA-H刺激不同时间点后,NO试剂盒检测NO的产生量。6.检测TRIM31对SYK活化的影响6.1检测CLR信号通路蛋白磷酸化取Trim31+/+和Trim31-/-小鼠的 BMDC 或者 BMDM,使用 HKCA-Y、HKCA-H、Zymd或者α-mannan刺激后,WB检测CLR信号通路分子SYK、PLCγ2、PKCδ、p65、ERK、JNK和p38总蛋白水平和磷酸化的变化。6.2外源过表达检测SYK的磷酸化将 Myc-Dectin-1、V5-SYK、Flag-TRIM31 或者 Flag-TRIM31（C53A,C56A）转染入HEK293T,HKCA-Y刺激细胞后,WB检测p-SYK的变化。将 Myc-Dectin-1、Flag-TRIM31、V5-SYK 或者 V5-SYK（K375R,K517R）转染入HEK293T,HKCA-Y刺激细胞后,WB检测p-SYK的变化。将 Myc-Dectin-2、HA-FcRγ、V5-SYK、Flag-TRIM31 或者 Flag-TRIM31（C53A,C56A）转染入HEK293T细胞,HKCA-H刺激细胞后,WB检测p-SYK的变化。将 Myc-Dectin-2、HA-FcRγ、Flag-TRIM31、V5-SYK 或者 V5-SYK（K375R,K517R）转染入HEK293T细胞,HKCA-H刺激细胞后,WB检测p-SYK的变化。6.3基因回补实验取Syk-/-小鼠的BMDC,慢病毒分别回补SYK,SYK加TRIM31,SYK（K375R,K517R）,SYK（K375R,K517R）加 TRIM31。用 Zymd 或 α-mannan 刺激细胞后,WB检测回补蛋白的表达,ELISA检测IL-6、TNF-α分泌水平的变化。7.检测TRIM31调控SYK转位到细胞膜与Dectin-1或者FcRγ结合7.1检测SYK与Dectin-1或FcRγ的外源结合将 Myc-Dectin-1 或者 Myc-Dectin-2、HA-FcRγ、V5-SYK、Flag-TRIM31或者 Flag-TRIM31（C53A,C56A）转染入 HEK293T,HKCA-Y 或者 HKCA-H 刺激后用Myc的抗体IP Dectin-1或者HA的抗体IP FcRγ,WB检测V5-SYK与Myc-Dectinl 或 HA-FcRγ 的结合作用。将 Myc-Dectin-1 或者 Myc-Dectin-2、HA-FcRy、Flag-TRIM31、V5-SYK 或者 V5-SYK（K375R,K517R）转染入 HEK293T,HKCA-Y 或者 HKCA-H 刺激后用Myc的抗体IP Dectin-1或者HA的抗体IP FcRγ,WB检测SYK（K375R,K517R）与 Myc-Dectin-1 或 HA-FcRγ 的结合作用。7.2检测SYK与Dectin-1或HA-FcRy的内源结合分别取Trim31+/+和Trim31-/-小鼠的BMDC,用Zymd或者α-mannan处理不同时间后,WB检测内源SYK与Dectin-1或FcRγ的结合。7.3检测SYK转位至细胞膜分别取Trim31+/+和Trim31-/-小鼠的BMDC,用Zymd或者α-mannan处理不同时间后,分离细胞膜和细胞质,WB检测各组分中SYK的蛋白量。同时,用共聚焦显微镜直接观察SYK向细胞膜转位的变化情况。8.检测TRIM31抑制SHP-1与SYK的相互作用8.1外源过表达检测SYK的磷酸化将Myc-Dectin-1、Myc-SYK、V5-SHP-1、Flag-TRIM31 或者 Flag-TRIM31（C53A,C56A）转染入HEK293T,HKCA-Y刺激后,WB检测SYK的磷酸化。将 Myc-Dectin-1、V5-SHP-1、Flag-TRIM31、Flag-SYK 或者 Flag-SYK（K375R,K517R）转染入HEK293T细胞,HKCA-Y刺激后,WB检测SYK的磷酸化。8.2 TRIM31调控SHP-1与SYK的内源结合分别取Trim31+/+和Trim31-/-小鼠的BMDC,用Zymd或者α-mannan刺激不同时间点后,检测内源SYK与SHP-1的结合。8.3 TRIM31调控SHP-1与SYK的外源结合将 Myc-SYK、V5-SHP-1、Flag-TRIM31 或者 Flag-TRIM31（C53A,C56A）转染入HEK293T细胞,用V5的抗体IP SHP-1,WB检测SHP-1与SYK的结合。三、实验结果1.TRIM31催化SYK发生泛素化修饰在HEK293T中筛选出泛素化调控SYK的成员:TRIM25、TRIM31和TRIM39。WB显示TRIM31发挥最强的催化作用。2.TRIM31 结合 SYK筛选出TRIM31后,接着探究TRIM31泛素化修饰SYK是否是因为两者之间存在相互作用。在外源过表达实验中,发现TRIM31确实与SYK相互结合,且与SYK的结合依赖于SYK的激酶结构域,与CLR通路其他上游主要分子并无结合作用。内源结合实验发现两者的结合作用伴随刺激明显增加。进一步探究两者是否为直接结合,发现TRIM31与SYK的体外纯化蛋白存在直接结合作用。3.TRIM31对SYK的第375位和第517位赖氨酸进行K27泛素化修饰3.1 TRIM31依赖E3泛素连接酶活性泛素化修饰SYK将 Myc-SYK、HA-Ub、Flag-TRIM31 或者酶活突变体 Flag-TRIM31（C53A,C56A）转染入HEK293T,anti-Myc抗体IP SYK,WB结果显示TRIM31依赖其酶活性对SYK进行泛素化修饰。与实验室已发现并报道过的TRIM31泛素化修饰MAVS作用相同,并且TRIM31对CLR信号通路的其他主要上游分子CARD9、BCL10、PLCγ2、SHP-2 和 PKCδ 以及受体 Dectin-1、Dectin-2、Dectin-3、Mincle和接头分子FcRγ均无泛素化修饰作用。3.2 TRIM31催化SYK发生K27位泛素化修饰由于泛素分子包含7个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63）,通过连接方式的不同可以形成多种泛素链,不同特定链型的泛素化修饰有各自的生物学效应。我们通过在HEK293T中的过表达实验发现SYK存在多种泛素化形式,而TRIM31明显增强其K27位的泛素化。获取Trim31+/+和Trim31-/-小鼠的BMDC,Zymd或者α-mannan刺激后,利用SYK内源抗体进行免疫共沉淀。WB结果显示,SYK的内源泛素化会随刺激增强,TRIM31敲除后,SYK的内源K27位泛素化水平明显降低,K48和K63无明显变化。3.3 TRIM31修饰SYK的赖氨酸位点为K375和K517SYK共有49个赖氨酸位点,为了明确TRIM31修饰的赖氨酸位点,我们在HEK293T细胞中过表达TRIM31、SYK和Ub,IP富集SYK后,进行质谱检测。质谱检测分析结果显示TRIM31对SYK的潜在修饰位点是:K124、K165、K261、K368、K375、K386和K517。接着我们构建了 SYK这些位点的赖氨酸突变为精氨酸的突变体:K124R、K165R、K261R、K368R、K375R、K386R 和 K517R,将这些突变体与TRIM31和HA-Ub（K27）过表达载体转染入HEK293T,发现TRIM31主要对K375和K517位点进行K27位泛素化修饰。4.TRIM31敲基因小鼠更易感白色念珠菌为了明确TRIM31泛素化修饰SYK的生理意义,分别取Trim31+/+和Trim31-/-雄鼠,尾静脉注射C.albicans,构建白色念珠菌感染的动物模型,每日观察发现:Trim31-/-小鼠体重下降更明显,且死亡率高;Trim31-/-小鼠肾脏、脾脏和肝脏组织的真菌滴度较高;肾脏组织切片结果显示:Trim31-/-小鼠肾脏组织损伤程度高,炎症反应严重,有大量菌丝残留,并且有大量的嗜中性粒细胞浸润;感染5 d后,Trim31-/-小鼠肾脏和肝脏组织中IL-6和TNF-α的含量也明显降低;感染5 d后,Trim31-/-小鼠血清中的IgG抗体的分泌量明显降低。Trim31-/-小鼠脾脏细胞受到HKCA-Y再刺激时,细胞上清中IFN-γ和IL-17A的分泌量较少,T细胞向Th1和Th17细胞分化量减少;肾脏组织中Ifng,Il17a和Il17f也明显降低了 mRNA的表达水平。此外,急性感染Calbicans24 h后Trim31-/-小鼠血清中的细胞因子:IL-6、TNF-α、IL-12、CXCL1和CXCL2的分泌量也明显降低。骨髓移植实验结果显示:TRIM31主要通过造血系来源的细胞发挥作用从而影响机体抗真菌免疫应答。这些结果明确了 TRIM31可能通过促进固有免疫细胞产生炎性细胞因子,进而增强适应性免疫应答,从而调控机体抗真菌免疫反应。5.TRIM31正调细胞水平抗真菌功能通过E3泛素连接酶活性明确了 TRIM31在小鼠体内具有明显的抗真菌能力,猜测可能是通过固有免疫细胞完成的,接着我们在体外探究TRIM31如何影响固有免疫细胞的抗真菌免疫应答。TRIM31敲除的BMDC或者BMDM,在细胞受到CLRs配体:Zymd、α-mannan、TDB、HKCA-H和HKCA-Y的刺激后,产生的炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-23和趋化性细胞因子CXCL1和CXCL2明显降低。在Trim31-/-小鼠的BMDC或者BMDM中,利用慢病毒分别回补TRIM31或 mTRIM31（C52A,C55A）,Zymd 或者 α-mannan 刺激后,TRIM31 回补成功的BMDC或者BMDM明显产生更多的IL-6和TNF-α,而回补TRIM31（C52A,C55A）的细胞并没有明显的变化,这说明TRIM31正调CLR介导的细胞因子的产生依赖其自身的泛素连接酶活性。BMDC和BMDM对真菌的吞噬作用是抵御真菌入侵的第一步,同时胞内产生的ROS和NO能够杀伤真菌。TRIM31敲除的BMDC或者BMDM,对于白色念珠菌的吞噬作用略有减弱。TRIM31敲除的BMDC或者BMDM,在受到Zymd、α-mannan、TDB、HKCA-H和HKCA-Y的刺激后,产生更少的ROS去杀伤真菌;HKCA-H和HKCA-Y的刺激后,NO的产生也是明显减少。这些结果更加明确了 TRIM31正调细胞抗真菌的应答。6.TRIM31促进SYK的活化明确了 TRIM31的泛素连接酶活性影响固有免疫细胞的抗真菌能力,前期结果也证明TRIM31能够泛素化SYK,那么TRIM31对SYK的泛素化修饰如何影响SYK的活化,还需进一步的探究。首先,我们获取Trim31+/+和Trim31-/-小鼠的 BMDC 或者 BMDM,用 HKCA-Y、HKCA-H、Zymd 或者 α-mannan 刺激细胞后,检测CLR信号通路分子磷酸化的变化,发现TRIM31敲除以后,SYK、PLCγ2、PKCδ、p65、ERK、JNK和p38的磷酸化水平明显变弱。说明TRIM31通过调控SYK的活化正调CLR信号通路。HEK293T中的过表达实验结果显示:TRIM31依赖其酶活性明显增强了 SYK的磷酸化,但TRIM31并不影响SYK（K375R,K517R）的磷酸化,说明TRIM31通过泛素化SYK的K375和K517位点从而增强SYK的磷酸化。基因回补实验结果显示:在Syk-/-小鼠的BMDC中回补SYK的同时回补TRIM31,配体刺激后明显增加了细胞IL-6和TNF-α的分泌。但回补SYK（K375R,K517R）并不能完全恢复细胞受刺激后IL-6和TNF-α的分泌,同时回补TRIM31和SYK（K375R,K517R）与只回补SYK（K375R,K517R）的效果无异。因此TRIM31对K375和K517位点的泛素化修饰增强了 SYK的活化,促进了 CLRs诱导的细胞因子的分泌。7.TRIM31促进SYK转位到细胞膜与Dectin-1或者FcRγ结合7.1 TRIM31 增强 Dectin-1 或者 FcRy 招募 SYKSYK在活化的过程中,构象发生改变且最终转位到细胞膜上与膜受体Dectin-1或者接头分子FcRy结合。HEK293T中的过表达实验结果显示:TRIM31依赖其酶活性明显增强了 SYK与Dectin-1或者FcRγ的结合作用,并且在HKCA-Y或者HKCA-H的刺激下,结合作用更明显。但TRIM31并不影响SYK（K375R,K517R）与 Dectin-1 或者 FcRy 的结合。同样的,获取了Trim31+/+和Trim31-/-小鼠的BMDC,使用Zymd或者α-mannan刺激,结果发现,TRIM31敲除以后内源SYK与Dectin-1或FcRγ的结合均减弱。说明TRIM31促进了 SYK与Dectin-1或FcRγ的结合作用。7.2 TRIM31促进SYK转位到细胞膜接着获取Trim31+/+和Trim31-/-小鼠的BMDC,Zymd或者α-mannan刺激,获取细胞裂解液后将细胞膜和细胞质组分分离开,WB检测分别在细胞膜和细胞质中的SYK蛋白含量,发现:细胞受到配体刺激后,SYK明显由细胞质转移到细胞膜,且TRIM31敲除后,SYK转移到细胞膜的蛋白量明显减少。通过荧光共聚焦显微镜我们也直接观察到了这一现象。获取Trim31+/+小鼠的BMDC,发现在Zymd的刺激下,SYK由在细胞质中分布变为向细胞膜聚集,和Dectin-1共定位变明显,并且细胞核周围出现大量吞噬小体。在α-mannan刺激下,SYK同样明显向细胞膜聚集,与FcRγ共定位变明显。但Trim31-/-小鼠的BMDC中,SYK向细胞膜聚集不明显,且与Dectin-1或者FcRγ的共定位较弱。以上结果证明,TRIM31增强SYK转位到细胞膜并与Dectin-1或者FcRγ结合。8.TRIM31抑制SHP-1对SYK的去磷酸化修饰8.1 TRIM31的泛素化修饰抑制了 SHP-1对SYK的去磷酸化SHP-1可以通过磷酸酶活性抑制SYK的活化。为探究TRIM31是否影响SYK活化后SHP-1对SYK的去磷酸化作用,我们在HEK293T进行了过表达实验。结果显示,TRIM31依赖其酶活性明显抑制了 SHP-1对SYK的去磷酸化作用,但是TRIM31并不能影响SHP-1对SYK（K375R,K517R）的去磷酸化作用。以上结果证明了 TRIM31对SYK的泛素化修饰能够抑制SHP-1对SYK的去磷酸化作用。8.2 TRIM31抑制SHP-1与SYK的相互结合作用为探究TRIM31抑制SHP-1对SYK的去磷酸化作用是否依靠抑制SHP-1与SYK的直接结合,我们获取了Trim31+/+和Trim31-/-小鼠的BMDC,Zymd或者α-mannan刺激后,用anti-SYK的抗体做IP,结果显示:Trim31-/-小鼠的BMDC中有更多的SHP-1与SYK结合。HEK293T中的过表达实验结果显示:TRIM31依赖其酶活性抑制了 SHP-1与SYK的直接结合作用。总的来说,TRIM31通过对SYK的K375和K517位点的K27位泛素化修饰,促进SYK转位到细胞膜与Dectin-1或者FcRγ结合,并且抑制SHP-1对SYK的去磷酸化作用,增强SYK的活化,最终正调CLR信号通路,发挥抗真菌功能。四、创新性1.SYK在抗真菌免疫反应中起重要作用,其泛素化修饰研究鲜有报道,我们首次发现了 TRIM31介导SYK发生K27位泛素化修饰,并且明确了修饰位点:K375和K517,为泛素化修饰正调SYK活化的研究填补了空白。2.SYK的活化被许多分子调节,在活化过程中自身结构发生改变,最终转位到细胞膜。我们首次发现TRIM31的泛素化可以促进其活化,最终与膜受体Dectin-1或者FcRγ结合,并且抑制了后续SHP-1对SYK的去磷酸化作用。研究结果首次明确了泛素化修饰参与了 SYK的活化与转位过程。3.TRIM31作为TRIM家族的成员,主要的报道是其在癌症、抗病毒以及炎症中的作用,我们首次发现TRIM31通过作用于SYK促进CLR通路活化发挥抗真菌功能,明确了 TRIM31在抗真菌免疫中的生理意义。