第一部分女性下生殖道感染相关的阴道微生物群落菌群多样性分析背景女性生殖道定植着数量巨大的不同种属的细菌,其对人体健康具有重要的作用。细菌性阴道病是一种阴道微生物群落菌群紊乱性疾病,每年影响数以百万计的育龄期女性,并与众多的不良健康后果如早产及感染性传播疾病等有关。然而,早期研究主要集中在阴道优势菌群在细菌性阴道病发病过程中的作用,很少了解阴道微生物群落的整体结构和组成及其在疾病发生发展和转归中的变化情况。此外,至今没有令人信服的证据证实女性生殖道中阴道微生物群落菌群多样性变化与宫颈炎和外阴阴道假丝酵母菌病有关。方法在本研究中,利用非培养的PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术和454焦磷酸测序方法,探讨来自中国的细菌性阴道病患者(50例)和健康体检女性(50例)的阴道微生物群落菌群多样性和丰度差异,并应用定量PCR进行结果验证。另外收集了100例受试者(包括30例细菌性阴道病患者,30例健康受试者,22例宫颈炎患者,18例细菌性阴道病合并宫颈炎患者)的阴道拭子和宫颈外口拭子,并应用PCR-DGGE技术探讨女性宫颈阴道优势菌群多样性,应用针对11种细菌种属的定量PCR探讨优势菌群在疾病发生发展过程中的变化情况。此外,采集48例外阴阴道假丝酵母菌病患者及32例细菌性阴道病合并外阴阴道假丝酵母菌病患者的阴道拭子,应用PCR-DGGE技术探讨阴道微生物群落菌群的组成和多样性。结果本研究数据表明,在细菌性阴道病发病过程中,阴道微生物群落菌群的绝对丰度和相对丰度有了一个剧烈的转换。尽管存在显著的个体间差异,但两组的阴道微生物群落菌群的多样性可被清楚地分为两个簇。454焦磷酸测序中,共有246,359条高质量的序列用于评估菌群多样性,并获得24,298独特的可操作分类学单位(OTUs)代表了所有种系型(phylotypes)。阴道微生物群落中发现的细菌最突出的门类,属于Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria和Fusobacteria。与以往的研究结果相似,细菌性阴道病患者阴道内存在的细菌种系型远远超过健康对照组,而且发现大量以往研究中未曾发现的低丰度菌群。尽管没有一个特异的细菌可以作为健康与细菌性阴道病发生的特异性标志菌属,但在患病的情况下,三个细菌门类-——Bacteroidetes, Actinobacteria和Fusobacteria,及八个细菌菌属——Gardnerella, Atopobium, Megasphaera, Eggerthella, Aerococcus, Leptotrichial Sneathia, Prevotella和Papillibacter是与细菌性阴道病密切相关的(p<0.05)。这些菌属是潜在的标记物,应用分子生物学的方法检测这些菌属可作为细菌性阴道病临床诊断的靶标应用。不过,除产过氧化氢和产乳酸的乳杆菌外,目前没有足够的证据证实宫颈阴道微生物群落(包括阴道菌群和宫颈菌群)直接参与宫颈炎的发生发展。另外,本研究也没有发现阴道微生物群落优势菌群和外阴阴道假丝酵母菌病之间的显著相关性。结论本研究已清楚描绘出阴道微生物群落的整体结构,并明确表明,细菌性阴道病是与阴道微生物群落菌群多样性和生物分类学丰富性急剧增加有关。这项研究还提供了目前关于阴道微生物群落结构和细菌的生态系统最全面的认识,并有助于目前对细菌性阴道病病因的了解。然而,阴道微生物群落优势菌群和外阴阴道假丝酵母菌病之间,宫颈阴道微生物群落优势菌群和宫颈炎之间没有显著的相关性。第二部分细菌性阴道病患者宿主阴道局部反应性变化研究背景目前,细菌性阴道病患者宿主易感性的决定因素仍知之甚少。宿主阴道粘膜局部的感染基因组学和感染蛋白组学可能在细菌性阴道病的发生过程中发挥了重要作用。方法为更深入的探索细菌性阴道病患者阴道局部对阴道菌群多样性变化的反应性,本研究对10例细菌性阴道病阳性和10例细菌性阴道病阴性女性阴道上皮细胞样本,应用Affymetrix基因表达谱芯片研究阴道上皮细胞基因表达谱的差异,并应用Bio-Plex Pro27蛋白悬液芯片探讨阴道灌洗液中的细胞因子表达的差异。结果Affymetrix基因表达谱芯片分析,共有2397个基因具有2倍甚至更高的改变,其中1234个基因表达上调,1163个基因表达下调,这些细胞因子主要参与TNF-αg.NF-κB.IFN-γ、IL-5和凋亡等炎症相关的信号通路。而蛋白悬液芯片细胞因子分析后,IL-1β、IL-5、IL-12、IFN-γ、RANTES和TNF-α在细菌性阴道病的发生发展过程中具有显著的改变(p<0.05)。结论在细菌性阴道病发病过程,患者阴道局部宿主反应明显,有众多炎症相关的基因表达差异明显,阴道灌洗液内的细胞因子特别IL一1β、IL-5、IL-12、IFN-γ、RANTES和TNF-α等明显增加,可能参与宿主抵抗细菌性阴道病相关菌群的入侵。第三部分阴道内应用甲硝唑和益生乳杆菌治疗细菌性阴道病的菌群重建研究背景应用分子生物学技术,目前已完全阐明了健康受试者和细菌性阴道病患者阴道微生物群落菌群组成及其多样性变化。然而,细菌性阴道病患者积极治疗后其阴道微生物群落菌群的整体结构及其组成,迄今为止仍然没有深入的研究。方法和结果应用454焦磷酸测序技术,每个样本经短疗程治疗后获得了超过4300条的16S rRNA基因V3区的扩增产物,其中30例甲硝唑治疗组(7天),25例益生乳杆菌活菌制剂(10天)及30例健康受试者和30例细菌性阴道病治疗前患者分别作为阴性对照和阳性对照。治疗结束后,细菌性阴道病在甲硝唑治疗组临床治愈率为83.3%,而乳杆菌活菌制剂治疗组为88.0%。甲硝唑治疗可根除细菌性阴道病相关的致病菌,明显减少了阴道微生物群落菌群多样性,而益生乳杆菌治疗组只能通过改善阴道微生态平衡,抑制这些细菌的过度生长,而不能改变阴道微生物群落菌群多样性。尽管存在显著的个体间差异,积极治疗组或受试者的阴道菌群构成一个独特的簇,可与治疗前组的细菌性阴道病患者明显区分开。随着那些细菌性阴道病的潜在致病菌,如Gardnerella, Atopobium, Prevotella, Megasphaera, Coriobacterineae-, Lachnospira, Mycoplasma和Sneathia等显著减少(p<0.05),一个以乳杆菌为主的阴道菌群不断恢复,可以重建新的阴道微生态平衡。作为阴道健康状况的哨兵细胞和生物标志物,乳杆菌和上述细菌性阴道病相关致病细菌的相对丰度可以监测细菌性阴道病的临床和微生物学治愈率,及治疗后复发率等。结论本研究数据表明,阴道内应用甲硝唑和外源性益生乳杆菌可以有效治疗细菌性阴道病,恢复正常阴道微生物群落,而益生乳杆菌可以维持一个相对较长时间的阴道微生态平衡。这些结果有助于阐明那些细菌性阴道病相关致病菌在细菌性阴道病发病过程中的作用和机制,可为今后细菌性阴道病的治疗提供了新的见解。