Ryanodine受体(RyR)是位于细胞内钙库——内质网和肌质网——膜上的一类钙释放通道，数个RyR同时开放出现的单位钙释放现象被称为钙火花(camunl spark)。本论文使用激光扫描共聚焦显微镜技术，观察分离的大鼠心室肌细胞的钙信号，特别是自发钙火花在渗透压应激(osmotic stress)和氧化应激(oxidatiVe stress)条件下的变化，研究了应激条件下RyR的原位调控及其生理功能的变化。研究内容分为两个部分： I．渗透压应激对大鼠心室肌细胞钙火花的影响。在渗透压应激和一些病理条件下，心肌细胞的体积和功能(包括电兴奋性和收缩特征)会发生改变。这部分工作研究了渗透压应激对自发钙火花频率和时空参数的影响及其作用机制，主要结果如下： 1．与正常渗透压相比，高渗引起完整心室肌细胞自发钙火花的频率增加，钙火花的空间参数减小而时间参数增加；而低渗的作用正好相反。 2．高渗增加完整心室肌细胞的胞浆自由钙离子浓度和咖啡因诱发的钙瞬变，低渗反之。提高外液中钙离子浓度也会增加胞浆钙和咖啡因诱发的钙瞬变，使钙火花频率增加，但钙火花的时空参数不变。 3．改变内液离子强度对去皮心室肌细胞钙火花频率和时空参数影响很小，且不同于渗透压。 4．Dextran是一种能够增加溶液粘度从而降低溶液中粒子扩散的物质。降低去皮细胞内液中dextran浓度，钙火花空间参数显著增加而时间参数显著减少，这与完整细胞上低渗的作用相同；提高内液中dextran浓度的作用则与高渗相似。 5．随着渗透压或dextran浓度增加，钙波的传播速度降低。 以上结果提示，渗透压对钙火花频率的影响可能源于胞浆和肌质网内钙离子浓度的改变，而渗透压对钙火花时空参数的影响则主要是由于细胞内钙离子扩散改变，后者可能与细胞形态的改变有关。渗透压应激条件下心肌收缩功能的变化可能与上述钙火花特征和钙波传播速度的改变有关。 Ⅱ．巯基氧化对大鼠心室肌细胞RyR的双相调控。大量的研究结果显示，在心脏衰竭和衰老过程中，氧化应激造成的细胞内钙超载会导致细胞的损伤和死亡。为更好了解氧化应激对RyR的调控，我们研究了4，4’-djthiodipyridine(DTDP，一种透膜的、巯基特异性的氧化剂)对细胞内钙信号特别是自发钙火花的作用。主要结果如下： 1．3μMDTDP对完整心室肌细胞的静息钙没有明显影响，而100 μMDTDP会引起短暂的钙瞬变。 2．高浓度DTDP(>3μM)造成细胞内自由锌离子浓度持续上升。 3．3μMDTDP单相增加完整细胞自发钙火花的频率：而高浓度的DTDP会使钙火花的频率双相变化，最后完全消失。DTDP对去皮细胞钙火花频率的作用同完整细胞。无论是完整细胞还是去皮细胞，DTDP对钙火花的时空参数都没有影响。 4．与对钙火花频率的作用相似，DTDP对咖啡因诱导的钙瞬变的幅度也具有双相作用。而且，DTDP对钙火花频率和咖啡因诱导的钙瞬变的抑制都能被DTT回复。 5．DTDP增加肌质网内的自由钙离子浓度，但在时间上它晚于DTDP引起的钙火花频率和咖啡因诱导的钙瞬变的增加。 以上结果表明，DTDP对钙火花频率的作用主要是通过对RyR或其复合体蛋白的直接调控而不是通过改变胞浆或肌质网内自由钙离子浓度。DTDP通过改变钙火花频率能局部影响钙介导的信号通路。因此，尽管轻度氧化应激并不引起细胞内钙超载，但它的功能意义仍不可忽视。 值得注意的是，在细胞中钙火花时程不被DTDP改变的结果与DTDP使重组RyR的单通道开放时间显著增加明显不同；离子强度对钙火花频率的影响也不同于它对重组RyR单通道活性的作用。这些差别表明，RyR的非原位行为不同于其原位的行为。因而，从非原位的结果推导到原位时要小心。这些差别还表明，对原位RyR门控机制的研究非常必要，这有利于我们进一步了解RyR在心肌细胞功能调控中的作用。