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目的:1.建立可长期培养的抗原特异性的Th1/Th2克隆及细胞系;2.克隆小鼠ROG基因,构建表达ROG的重组腺相关病毒载体pAAV-ROG,制备表达ROG的重组腺相关病毒rAAV-ROG,研究rAAV-ROG对哮喘的保护作用。 方法:用卵蛋白(OVA)免疫Balb/c小鼠,10-14d后取淋巴结细胞在体外用同系脾细胞和OVA反复刺激,然后分别用IL-2、IFNγ及IL-2、IL-4共同培养,并同时加入同系脾细胞和OVA,进行Th1和Th2克隆的诱导,并通过有限稀释法进行克隆化培养。对克隆化的细胞用ELISPOT技术检测其分泌细胞因子的特性。 设计、合成引物,通过RT-PCR法从CTLL-2细胞总RNA中扩增ROG基因,测序成功后,最终连接于pAAV-MCS,双酶切、PCR鉴定阳性重组质粒,并在Hela细胞中表达,测序鉴定其正确性;大量制备pAAV-ROG、pAAV-RC、pHelper、pAAV-LacZ质粒,并调整质粒浓度到1μg/μl。应用DMEM高糖培养基,AAV-293细胞超过50%传代;培养AAV-293细胞使之达到70-80%融合用于转染。转染方法采用磷酸钙法,分六组,A组:不加DNA;B组:pAAV-ROG、pAAV-RC、pHelper各10μg共转染AAV-293细胞。C组和D组:分别取pAAV-rhGFP和pAAV-LacZ取代pAAV-ROG,与pAAV-RC、pHelper为对照。E组和F组:分别为不加pAAV-RC、pHelper,其它操作均同B。镜下观察病毒颗粒的产生及培养基的变化。转染后6小时换新鲜培养基,72h收集细胞及培养基置于离心管中,将离心管交替置于干冰及37℃水浴中各10分钟,交替4次后室温离心,取上清-80℃冻存。进一步浓缩采用无水乙醇法。用Hela细胞通过测定对照rAAV-LacZ的病毒滴度间接确定rAAV-ROG、rAAV-rhGFP的滴度。 制备小鼠支气管哮喘模型:应用卵蛋白,动物用Balb/c鼠,雌性,体重25-30mg,随机分为3组,A组:以PBS代替OVA激发与致敏;B组和C组均