副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,Vp)是常见于海鲜产品中的一种食源性致病菌,主要分布在鱼、虾、蟹、牡蛎、贝类等海鲜类产品中。传统培养方法(GB 4789.7-2013)检测周期较长,耗时费力,且无法检测出活的但不可培养(Viable but non-culturable,VBNC)状态的副溶血性弧菌。分子检测技术虽然在检测时间、灵敏度、特异性方面具有明显的优势,但无法排除死细胞DNA的扩增信号。叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide,PMA)可以特异的穿透死细胞的受损细胞膜,嵌入到DNA分子中,阻止其发生扩增反应,从而使得分子检测方法排除了死细胞DNA扩增信号的干扰,实现活菌检测,提高检测的准确度。本研究首先设计筛选2条适宜的引物,用于识别副溶血性弧菌toxR基因上的特定靶向位点。将跨越式滚环等温扩增技术与EvaGreen荧光染料结合,建立实时荧光跨越式滚环等温扩增(Real-time fluorescence saltatory rolling circle amplification,RF-SRCA)方法,并对RF-SRCA反应条件和反应体系进行优化。将RF-SRCA与PMA染料结合,并对PMA染料的处理条件进行优化,建立PMA-qSRCA活菌检测方法。对该方法的特异性、灵敏度、检出限和定量限以及精确度进行评价。最后将此方法用于实际样本检测。PMA-qSRCA活菌检测方法的优化结果显示:适宜反应温度为62℃,适宜反应体系为:dNTPs 0.50 mM,Mg2+3.00 mM,1 × ThermoPol Reaction Buffer,FWP 0.50μM,RVP 0.50 μM,DNA 模板 3.56 ng/μL,0.60 U/μL Bst DNA 聚合酶,1 × EvaGreen,添加无菌去离子水将反应体系补足至20.00 μL。PMA适宜浓度为40 μM,孵育时间为8 min,光照时间为15 min。特异性试验结果显示:12株副溶血性弧菌均为阳性结果,29株非副溶血性弧菌均为阴性结果。因此,该检测方法特异性良好。以不同菌液浓度的纯菌液对PMA-qSRCA方法的灵敏度进行评价,以含有不同浓度副溶血性弧菌的牡蛎样品对PMA-qSRCA方法的检出限及定量限进行评价,并与PMA-qLAMP、PMA-qPCR方法比较。结果显示:PMA-qSRCA方法的灵敏度为3.20 × 100 CFU/mL,较PMA-qLAMP方法高10倍,较PMA-qPCR方法高100倍。PMA-qSRCA方法的检出限为2.08 × 101 CFU/g,较 PMA-qLAMP 方法低 10 倍,较 PMA-qPCR 方法低 100 倍。PMA-qSRCA方法的定量下限为2.08 × 102 CFU/g,较PMA-qLAMP、PMA-qPCR方法低10倍。将PMA-qSRCA方法的检测效果与平板培养法和qSRCA法进行对比分析,以评估PMA-qSRCA活菌检测方法的精确度,结果显示:在不同的活菌比例(0%～100%)细胞混合液中,PMA-qSRCA方法与平板培养法结果无显著差异(p>0.05)。当细胞混合液中活菌比例在0%～80%范围内时,qSRCA方法与以上两种方法的检测结果差异显著(p<0.05)。但当细胞混合液中活菌比例为100%时,三种方法的检测结果相似(p>0.05)。因此,PMA-qSRCA方法具有较高的精确度,可以准确用于活副溶血性弧菌的检测。以国标方法(GB 4789.7-2013)为参照标准,采用PMA-qSRCA方法对76份海鲜样品进行了实样检测,对其敏感性、特异性、符合率进行评价。结果显示:PMA-qSRCA方法阳性样品检出率为69.74%,国标方法阳性检出率为67.11%。经计算,PMA-qSRCA方法的敏感性为100.00%、特异性为92.00%、符合率为97.37%。综上所述,本试验所建立的PMA-qSRCA方法特异、灵敏、准确、快速,适用于活副溶血性弧菌的检测,具有显著的优势。同时,亦为食品中食源性致病活菌的快速检测与筛查提供了新方法,具有较大的应用潜力。