DNA上有丰富的修饰,绝大多数的修饰位于DNA的碱基上,其中5-甲基胞嘧啶(^5mC)的研究最为深入。^5mC通过^5mC识别结构域（SET-and RING-associated domain,SRA）参与到DNA的复制、基因的调控等方面,与表观遗传学息息相关,这类DNA修饰也称为表观遗传修饰。此外,还有一类特殊的修饰是位于DNA骨架上的磷硫酰化修饰（也称为硫修饰;phosphorothioation,PT）,它的结构是硫原子取代DNA磷酸二酯键上非桥接的氧原子。在细菌中,表观遗传修饰更多的是参与到DNA的限制修饰系统（Restriction and modification system）中。DNA限制修饰系统根据限制酶和修饰酶的亚基组成、识别序列、辅助因子、切割方式的不同,又可以分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型。其中,Ⅳ型又称为修饰依赖型限制系统,而通过凝胶电泳可以产生清晰且固定的切割条带的Ⅳ型限制性内切酶也被归类为IIM型核酸酶。前期本研究组在天蓝色链霉菌中发现了一个IV型核酸酶ScoMcrA,只有当DNA被硫修饰或^5mC修饰时,才能被其识别和切割,蛋白质晶体结构揭示其同时包含硫修饰结合结构域（SBD）和^5mC结合结构域（SRA-like）。同时,ScoMcrA有以下特性:1)只识别并切割对称的靶序列(5′-G_PSGCC-3′),无法知道一分子DNA被切几次或在哪一侧切割;2)体外区别硫修饰和非硫修饰DNA特异性较差（反应时间不能超过5分钟）;3)切割硫修饰DNA活性较差。这些特点不利于深入研究其酶学活性和切割机理。因此,我们期望找到一个活性更高,靶序列不同或特异性更好的硫修饰依赖型核酸内切酶来实现这些目标。以ScoMcrA的SBD检索数据库发现:包含SBD的同源蛋白按照结构域排列和大小分为三类:1)head-SBD-SRA-HNH;2)head-SBD-HNH;3)SBD-HNH。来源于始旋链霉菌的SprMcrA属于最小的一类同源蛋白,它仅含326个氨基酸,包含SBD-HNH双结构域。体内限制实验中它对dnd基因簇有>10³的限制频率,是一个具有生物学活性的磷硫酰化修饰依赖型核酸限制酶。与ScoMcrA相比,SprMcrA的SBD结构域与硫修饰DNA的结合力以及序列特异性方面有较大差异:1)SBD_Spr可以结合三种天然硫修饰核心序列（GGCC、GAAC、GATC）硫修饰DNA,无论修饰发生在上下链（fully）或一条链（hemi）;对另外两种天然核心序列（GTTC,CCA）的硫修饰DNA（fully-或hemi-）均没有结合力;而SBD_Sco只结合核心序列GGCC;2)SBD_Spr对于同一核心序列的硫修饰DNA结合力比SBD_Sco要大。此外,与SBD_Sco相似,SBD_Spr在EMSA实验中只结合R_P构型的磷硫酰化修饰,对于S_P和正常DNA不结合。SprMcrA包含一个非典型的HNH结构域,只有在Mn²⁺或Co²⁺存在时具有DNA的切割活性。以人工合成的硫修饰寡聚核苷酸双链或硫修饰质粒DNA作为底物进行体外切割反应时,SprMcrA在约一半的硫修饰位点(G_PSAAC)的5′端进行双链DNA切割,切割位点距离磷硫键N11/N12（上链12个核苷酸/下链13个核苷酸）或N13/N14。同时也发现SprMcrA的HNH结构域本身具有DNA序列选择性,已有切点统计HNH的序列特异性为VBN↓VB。SprMcrA对硫和非硫修饰的DNA有>16倍的特异性,切割方向和切割位点固定,可归类于IIM型限制性内切酶。野生型HNH_Spr结构域中保守的N被R取代,我们通过定点突变获得SprMcrA_R284N突变体蛋白,SprMcrA_R284N的切割活性比野生型提高了约30倍,同时也影响到了切割序列的特异性。通过对突变体蛋白与野生型蛋白三级结构的预测,推测了R284N对切割活性影响的分子机制。为了解释SBD_Spr与SBD_Sco结合不同硫修饰序列DNA的特异性,本研究解析了SBD_Spr与PT-DNA（phosphorothioated DNA）的复合体结构。SBD_Spr与PT-DNA的结合力,主要由三个部分提供:通过疏水范德华力与DNA上硫原子结合的口袋、插入DNA双螺旋大沟中通过氢键作用力与碱基相互作用的碱基识别无规卷曲（‘base contact’loop）、通过静电作用力与DNA磷酸根相互作用的磷酸结合无规卷曲（‘phosphate binding’loop）。通过和SBD_Sco的结构进行比较,我们发现,决定SBD底物选择宽泛性的关键因素是‘phosphate binding’loop的电荷性。我们构建了ScoMcrA_E156R/D157R突变体蛋白,体内限制实验证实了E156R/D157R双突变可以使其获得体内限制来自大肠杆菌B7A的dnd基因簇(负责G_PSAAC/G_PSTTC修饰)的能力。综上所述,本研究对磷硫酰化修饰依赖型的IIM型限制性内切酶SprMcrA进行了相关的功能和结构研究。确定了SprMcrA的识别序列和切割位点,加深了对这一类酶功能上的认识,并通过点突变提高了SprMcrA的切割活性,为将SprMcrA发展成为一个针对PT-DNA的工具酶奠定了基础。探讨了SBD结构域对PT-DNA序列识别特异性的分子机理,通过定向改造成功改变了ScoMcrA的序列识别特异性,为核酸结合蛋白序列特异性改造提供了新思路。