亚氨基二乙酸(IDA)是一种重要的螯合剂中间体,广泛用于农药生产、电镀行业和染料等方面。随着草甘膦销量的逐年递增,目前国内的亚氨基二乙酸的生产能力远远不能满足需求,因此亚氨基二乙酸生产的研究具有很大的发展潜力。现今,亚氨基二乙酸的生产主要采用化学法,生产技术成熟,生产规模大,但是,生产过程中会出现副产物多、环境污染严重等问题。而酶法水解腈类化合物具有反应条件温和、环境污染小、成本较低、产物光学纯度高等的优点,所以在节能减排、绿色环保成为世界发展主题的今天,生物法水解腈类化合物受到了前所未有的关注。本论文围绕构建基因工程菌来生产亚氨基二乙酸展开研究,通过基因工程手段克隆得到了来源于Acidovorax facilis的腈水解酶基因,该腈水解酶基因全长1121bp,共编码374个氨基酸。通过将腈水解酶基因连接到表达载体pET-28b(+)中,并将重组质粒pET-28b(+)-NIT转入E.coli BL21(DE3)中,成功构建了E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-NIT。诱导表达的重组菌经SDS-PAGE分析显示该腈水解酶的蛋白大小约为42kDa。以亚氨基二乙腈为底物进行催化反应检测酶活,该基因工程菌的菌体酶活为72U/g(DCW),电泳纯腈水解酶的酶活为89U/mg protein。论文对E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-NIT的产酶条件进行了优化,得到的最佳摇瓶培养基组成成分为(g/L):蛋白胨15,酵母粉10,(NH4)2SO45,NaCl10,甘油 10,KH2PO4 1.5,K2HPO43H2O2.3,MgSO47H2O 0.375,最佳初始pH为7.0-7.2,摇瓶培养装液量为50mL/250mL。对该重组菌的诱导条件进行了优化,得到最佳诱导条件:诱导剂为0.1mMIPTG,诱导温度为28℃,诱导时间为20h。采用优化后的培养基及培养条件,诱导表达20h后,菌体干重达到了5.48g/L(DCW),菌体酶活达到了 86.66U/g(DCW)。分别为初始条件下的2.4倍和1.2倍。以亚氨基二乙腈为底物对该重组腈水解酶进行酶学性质研究,包括酶在不同底物浓度的进程曲线、催化最适温度、温度稳定性、催化最适pH、pH稳定性、金属离子以及化学试剂对酶活的影响等。通过研究可以得知该腈水解酶的最适反应温度为45℃,在35℃下热稳定性较好,当温度达到70℃时,酶几乎完全失活,酶的Tm值为57℃。酶在偏酸性的条件下酶活达到最高,其最适宜的转化pH值范围为6.5-7.5,在pH为6.5时的稳定性最好,当反应体系中添加Ag+,Hg+金属离子时,腈水解酶的酶活基本完全丧失。论文考察了七种不同的固定化方法,发现E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-NIT最适宜的固定化方法为聚乙烯醇(PVA)-海藻酸钠(SA)复合包埋法,表现出与游离细胞相似的催化性能(残余酶活为98.1%)。经优化后的固定化各组分成分为:1.0%SA,8.0%PVA,10%CaCl2,菌体浓度为5.0%,底物浓度为1.0%。通过研究催化pH、温度对固定化细胞催化的影响,发现与游离细胞相比,固定化细胞更适宜在pH小于7.0的偏酸性环境下进行催化,而当pH值分别为3.0和10.0时,固定化化细胞和游离细胞的相对酶活均不到6.0%,说明他们均不能耐受强酸、强碱条件。固定化细胞的最佳催化温度为40℃,而游离细胞的为45℃,在温度稳定性方面,固定化细胞与游离细胞均表现出相似的趋势。固定化细胞的最大优势表现在其操作稳定性上,当转化批次为10时,固定化细胞的相对酶活还有35%左右,而游离细胞在转化批次为9时就完全丧失活性。当固定化细胞扩大到气升式反应器时,除了最佳转化时间有原来的8h延长至10h,在底物为1%时转化批次为5次时的剩余酶活为原来的60%。