NO2作为NOx的主要成分,是目前世界各国尤其是发达地区的主要大气污染物,和TSP、PM10、SO2等一同被列为各国大气环境质量监测和控制的重要对象。室外大气NO2主要来源于煤炭燃烧和汽车尾气排放,室内NO2主要来源于燃煤灶、燃气灶使用和抽烟等,许多职业场所包括用乙炔吹管焊接、电镀、会属清洗、采矿、染料制造、油漆以及公共场所如车库、渡轮和滑雪场中也可接触到高浓度N02。室外交通拥挤路段N02浓度一般不超过0.2ppm,室内则可高达2ppm,在职业暴露场所甚至会达到4ppm。因此,N02所引发的健康问题成为了国际共同关注的焦点话题。文献提示,NO2由口鼻进入体内时可通过腐蚀和刺激作用损害呼吸道深部细支气管及肺泡,故而,人们对NO2污染诱导呼吸系统损伤进而诱发相关疾病的效应给予了大量的关注,却忽视了它对其它组织系统的影响。近年来,关于NO2诱导各类疾病病死率上升的流行病学数据大量涌现,特别是有学者指出,NO2会影响心脑血管系统和神经功能,并提示肺和支气管不是NO2毒性作用的唯一靶器官。因此在第一部分实验中,我们首先对正常大鼠进行了不同浓度(O、5、10和20mg/m3)NO2的吸入染毒处理,进而从氧化应激、炎性反应和细胞凋亡等多个角度考察了NO2对心脑组织的毒性作用。其中,组织病理损伤采用常规HE染色技术,而细胞凋亡则通过TUNEL标记法进行定量检测；抗氧化酶Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和GPx的活性及NO和氧化产物MDA含量检测采用试剂盒法,PCO含量检测采用DNPH比色法；炎性因子TNF-α和IL-1β水平检测采用Elisa试剂盒法；即早和凋亡相关基因mRNA的表达检测采用实时定量RT-PCR技术。结果,在心肌组织中发现,NO2吸入可引起心肌组织的轻度病理学损伤,表现为心肌纤维排列紊乱,间隙变宽,心肌细胞收缩,染色质崩解团块,细胞核肿胀或收缩,并伴随浓度依赖性的炎性浸润。NO2吸入可促进或抑制抗氧化物酶的活性,促进氧化产物的形成；上调炎性因子TNF-α和IL-1p的表达与活性；上调凋亡相关基因p53的表达及bax与bcl-2的比值,导致细胞凋亡数目增加。与此同时,在大脑组织中检测到了与心肌组织中相类似的毒性损伤表现,包括组织病理损伤、细胞凋亡数量增加、抗氧化系统失调(Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、GPx和NO活性及PCO含量)、即早基因(c-fos、c-jun)和凋亡基因(p53、bax和bcl-2)表达改变等多个方面。以上研究充分说明NO2吸入暴露可引起心肌和大脑毒性损伤,这可能会导致心脑血.管系统和神经系统疾病易感性的增加。缺血性中风是当今社会导致人类死亡的第二大疾病,也是世界上致残性最强的疾病,其发病率极高,每年影响大约0.2%的人群的生命健康。在中国,缺血性中风每年以约9%的速度在增长。在美国,缺血性中风趋于年轻化,近十年5-44岁之间人群该病的发病率增长了近3倍之多。令人担忧的是,到目前为止,关于诱导缺血性中风发生的致病因子还未被完全揭示,也尚未找到对该疾病病死率进行控制的有效措施。近十年来,越来越多的流行病学调查报道,户外大气污染与中风的病死率相关,其效应污染物主要包括NO2、SO2、O3、CO和PM10等。不仅如此,更有学者发现N02可影响缺血性中风的发展结局,导致患者的早期死亡。然而,流行病学结果受样本量、调查范围和评定方法等方面的局限,且混杂因素较多,使得其结果可靠性较低,无法给出定性而统一的结论,更不能阐明相关分子机制。因此,在上一部分内容的基础上,我们重点探讨了N02与缺血性中风发生发展的相关性。血液流变学指标的检测采用宏润达YDA-IV全自动血液流变仪和旋转粘度仪进行测定；缺血性中风模型制备采用可逆性大脑中动脉闭塞(MCAO)线栓法；神经功能检测采用症状评分法；缺血局灶采用TTC染色法；组织病理和细胞凋亡分别采用HE和TUNEL法。结果发现,N02长期低浓度(5mg/m3)吸入可引起健康大鼠血液黏度,红细胞聚集指数、电泳指数和刚性指数等指标的上升,这一现象类似于缺血性中风患者的血液流变学特征。与此同时,我们建立了大鼠缺血中风模型并对其进行相同浓度的N02暴露,为期一周,结果发现,N02可时间依赖性地抑制MCAO大鼠神经结构和功能的恢复,加重MCAO引起的组织病理损伤和细胞凋亡。通过以上研究,我们证实了N02暴露诱导缺血性中风发生发展的效应。内皮和炎性反应是缺血性中风发生发展过程中的两大主要病理机制。为了进一步阐明N02暴露诱导缺血性中风发生发展的具体分子机制,我们对Wistar大鼠进行了不同浓度N02的吸入染毒处理并考察了中风相关内皮和炎症因子的表达情况,结果发现,N02吸入可诱导大脑皮层内皮收缩因子ET-1、诱生型一氧化氮合酶iNOS、环氧化酶COX-2和细胞间黏附分子ICAM-1等因子mRNA和蛋白的表达而抑制内皮型一氧化氮合酶eNOS和脑型一氧化氮合酶nNOS的表达。在此基础上,我们又考察和比对了MCAO中风模型大鼠N02暴露前后大脑皮层以上因子的表达变化情况,结果发现MCAO处理同样引起了大鼠大脑皮层的内皮功能失调和炎症反应,而N02暴露会进一步加剧该损伤过程。本部分内容中中风相关因子mRNA和蛋白的表达分别采用了RT-PCR和Western blot技术,研究结果提示N02吸入通过内皮和炎性机制诱导了缺血性中风的发生发展,即：一方面打破内皮收缩因子的拮抗平衡,引起脑部血流减少,进而造成缺血损伤；另一方面诱导I1-1p、TNF-α的释放和iNOS、COX-2、ICAM-1的过表达,促进血液中炎性细胞的黏附和浸润,进而引起血液凝固,促进血栓形成,最终影响脑部血液供应,造成神经元凋亡和坏死。为了验证以上结果,我们又对健康大鼠进行了长时间的暴露染毒,发现eNOS、COX-2和ICAM-1在长期暴露后表达趋势与短期暴露结果相吻合,提示其可作为指示N02诱导缺血性中风效应发生的生物标记。血管性痴呆是指因各种脑血管疾病,尤其是脑缺血等引起的脑功能障碍而造成的获得性智能障碍综合征,是缺血性中风的主要并发症或后遗症。我们的研究发现,N02吸入暴露引起了中风模型大鼠神经功能恢复的推迟,在一定程度上提示N02可能会增加血管性痴呆发生的风险。然而,到目前为止,该效应还未被阐明,相关分子机制则更不清楚。由于突触可塑性是大脑进行正常功能活动的分子细胞学机制和神经系统生长发育、神经损伤修复以及学习记忆的神经生物学基础,因此在本研究中将突触可塑性变化作为切入点来研究N02增加血管性痴呆患病风险的效应及其可能的分子机制。电镜观察结果显示,5mg/m3的N02吸入暴露不仅会加重缺血性中风模型大鼠大脑海马区神经元和突触的超微结构损伤,同时会诱导健康大鼠的神经元损伤效应。与此同时的Western Blot实验证明,N02吸入抑制了中风模型大鼠突触结构可塑性标记分子SYP和PSD-95的表达,以及突触功能可塑性LTP过程中关键调控因子蛋白的表达。与此相反,在健康大鼠中N02吸入却诱导了以上绝大部分蛋白的表达上调,并呈现出一定的浓度依赖性。以上结果提示,NO2吸入暴露会通过诱导健康大鼠的神经兴奋性毒性和降低中风模型大鼠的突触可塑性增加血管性痴呆发生的风险。本课题实验结果揭示了N02对心脏和大脑组织的损伤效应,其分子机制与NO2对组织细胞的氧化作用有关,通过刺激炎症反应最终导致细胞的大量死亡,为肺以外其它组织中N02的毒性效应研究提供了一定的实验依据；阐明了N02与缺血性中风发生发展的相关性及其分子机制,建立了进行检测和危险度评价的生物标记；探讨了NO2与血管性痴呆发生发展的相关性及其突触机制,为污染事件发生时的临床治疗提供理论依据。