目的：本研究应用两步离心法制备PRP,通过分析PRP中血小板、白细胞和生长因子的浓度,计算回收率和富集系数,并做相关性分析,探讨PRP制备方法的实用性和稳定性。关节退变临床产生关节疼痛,活动受限和关节畸形等症状,是导致患者长期痛苦和身体残疾的常见原因,不仅极大地影响了人们的生活质量,导致人力资源的丧失,也给家庭和社会带来沉重负担。传统方法存在诸多弊端和生物学技术不断取得新进展的今天,PRP技术为我们治疗骨性关节炎提供了一种崭新的治疗思路和方法。通过关节内注射的方法,将PRP与玻璃酸钠作比较,探讨关节内注射PRP治疗关节软骨退行性变的安全性和疗效。慢性难愈性创面的治疗一直是医学研究的热点,传统的伤口换药、清创手术、负压真空吸引和局部应用各种药物等治疗,能清除局部感染灶或坏死组织,减少溃疡分泌物,但仍有许多创面难以愈合,我们采用局部喷洒PRP的方法治疗慢性难愈性创面,探索PRP治疗慢性难愈性创面的安全性和疗效,同时通过体外实验评价其抗感染作用。方法：(取30例成年健康自愿者捐献的外周血,男女各15例；年龄24-76岁,平均47岁。用预先装有5 mL枸橼酸钠注射液的50 mL一次性注射器以18 G针头于每例志愿者肘前静脉取血40 mL。摇匀后,取1 mL作血细胞分析,4 mL作生长因子浓度测定；剩余40 mL注入PRP制备套装离心管中,于严格无菌状态下制备PRP。根据血液中各组分的沉降系数不同,以离心半径15 cm、2000 r/min离心10 min后,全血分为3层,上层为上清液,下层为红细胞,两层交界处一浅黄色层即PRP层。分别将1 mL抗凝静脉血和制备的PRP采用全自动血液分析仪进行血常规分析,测定血小板及白细胞浓度,并计算PRP中血小板和白细胞浓度变异系数。计算PRP中血小板或白细胞回收率和富集系数,回收率=PRP中血小板或白细胞总数／全血中血小板或白细胞总数×100%,富集系数=PRP中血小板或白细胞浓度／全血中血小板或白细胞浓度。分别测定男、女自愿者PRP血小板及白细胞浓度。生长因子浓度测定于4 mL抗凝静脉血中加入0.4 mL凝血酶和氯化钙混合物(2000 U凝血酶中加入5 mL 5%氯化钙溶液),3 min后血液凝聚成冻胶状,常温下静置1 h后,同上法离,010 min,吸取上清液转移到冻存管中。将制备的PRP采用相同方法制备得到富含生长因子的上清液。取制备的全血及PRP上清液,按照ELISA试剂盒说明测定PDGF、TGF-β及VEGF浓度。将30例慢性关节疼痛或肿胀(不得少于4月),X或MRI有退行性变表现的膝关节软骨退行性变患者纳入研究。根据患者的年龄、性别、体重指数以及Kellgren & Lawrence骨性关节炎分级情况将30例病人分配到PRP组(试验组)和透明质酸钠(Sodium hyaluronate, SH)。试验组15例患者(15膝),每次关节内注射3.5 mLPRP,对照组15例患者(15膝),每次关节内注射透明质酸钠(Sodium hyaluronate, SH) 2 mL。所有患者每3周注射一次,连续3次为一个疗程。通过记录治疗过程中相关不良事件的数量、发生时间、严重程度、持续时间和处理结果来评估该治疗方法的安全性。通过比较注射前和3、4、6月随访时的国际膝部文件委员会(IKDC)主观膝部评估表、WOMAC评价表、Lequesne指数评估表来评估其临床疗效。将符合选择标准的21例慢性难愈性创面患者纳入本项研究。男8例,女13例；年龄48-78岁,平均58.5岁。开放原始创面,彻底清创,按照1：10的比例将制备的2-8mL自体PRP与促凝剂(2000U凝血酶中加入5mL 5%氯化钙溶液)同时缓慢喷洒入创面并尽量覆盖所有创面。3min后创面表面形成一层PRP凝胶,取大小合适的无菌透明薄膜覆盖于创口,四周密封确保PRP不流失,术后1周内建议患者尽量减少创面临近关节的活动量。术后可视情况更换无菌敷料,一般1周左右查看创面。嘱患者避免用手碰触患处,根据创面情况决定PRP使用的次数。采用滴注无菌生理盐水的方法测定伤口体积和计算创面覆盖率,我们将3个月内的创面愈合情况分为如下五个等级：Ⅰ级完全愈合,覆盖率100%；Ⅱ级明显愈合,覆盖率在75%-100%之间；Ⅲ级有效愈合,覆盖率在50%-75%之间；Ⅳ级部分有效愈合,覆盖率在25%-50%之间；V级无效愈合,覆盖率低于25%。对于3个月后没有痊愈的患者,在征求他们同意的情况下给予再次PRP治疗或继续观察治疗。于治疗前及3月随访结束时分别行创面内分泌物细菌培养,对比观察。选取创面感染最常见的金黄色葡萄球菌作为实验菌株,分别在PRP凝胶及PRP等培养基中孵育,分别于2、4、6、8、12、24h取样计数菌落数,绘制时间-抑菌曲线图,计算细菌减少率。结果：研究发现全血和PRP中血小板浓度分别为(131.40±29.44)×109/L和(819.47±136.32)×109/L,比较差异有统计学意义(t=-27.020,P=0.000)；PRP中血小板回收率为60.85%±8.97%,富集系数为6.40±1.06。全血和PRP中白细胞浓度分别为(5.57±1.91)×1012/L和(32.20±10.42)×1012/L,比较差异有统计学意义(t=-13.780,P=0.000)；PRP中白细胞回收率为58.30%±19.24%,富集系数为6.10±1.93。PRP中血小板浓度和白细胞浓度分别与全血中血小板浓度(r=0.652,P=0.000)和白细胞浓度(r=0.460,P=0.011)成正相关。男性组和女性组PRP中血小板浓度和白细胞浓度比较差异均无统计学意义(P>0.05)。PRP中PDGF、TGF-β、VEGF浓度分别为(698.15±64.48)、(681.36±65.90)(1071.55±106.04)ng/mL,是全血的(5.67±1.18)、(6.99±0.61)、(5.74±0.83)倍。PRP中PDGF浓度(r=0.832,P=0.020)、TGF-∞浓度(r=0.835,P=0.019)、VEGF浓度(r=0.824,P=0.023)均与PRP中血小板浓度成正相关。在关节软骨退变部分的临床研究中未发生关节内感染、肌肉萎缩、深静脉血栓、发热、血肿和异常组织增生等不良反应,与对照组相比试验组未表现出有更长的不良反应持续时间(P=0.862),所有出现不良反应的患者在得到合理治疗后都在4天内恢复到治疗前状态。试验组患者的评分在6个月内保持了稳定,而对照组只在前4个月内保持了稳定,在第6个月随访时就表现出明显的减低(PIDC=0.003, PWOMAC=0.048, PLequesne=0.002)。在前4个月内试验组患者的状态改善并不优于对照组(P>0.05),但在随访到6月时IKDC评分和Lequesne指数的改变提示此时试验组患者膝关节状态优于对照组(P,KDC=0.000, PLequesne=0.013)。短期结果证实关节内注射PRP治疗关节软骨退行性病变是安全的,其长期疗效可能会优于透明质酸钠。在难愈性创面的研究中未发生创面感染加重、菌血症、局部异常组织增生等不良反应。治疗后第1、2、4周随访时创面覆盖率分别为(55.1±22.6)%、(72.0±16.2)%,(84.3±14.0)%,周间差异有统计学意义(P<0.05),说明在治疗的4周内,创面处于持续修复状态。3个月随访时,创面体积为(1.5±1.8)mL,创面平均覆盖率为85.6%,治愈率为57.1%,治疗的有效率和患者主观满意率均为95.23%。体外抑菌结果显示PRP凝胶抗菌作用明显,细菌数量于孵育4 h时降至最低。结论：结合二次离心法使用PRP制备套装可以稳定地制备出富含高浓度血小板、白细胞和生长因子的PRP。关节内注射PRP为临床治疗膝关节退行性变提供了一种可能的选择,但是需要大样本的随机对照研究的长期随访结果以进一步证实其安全性和疗效。PRP不但能有效安全的促进慢性难愈性创面的愈合,并有潜在的抗感染作用。意义：通过对PRP细胞成分的检测、抗菌活性的测定等多个层面的研究,确定了制备PRP的最佳离心时间及离心力,为PRP在骨科的临床应用提供理论依据和现实指导。利用自体PRP来解决关节软骨损伤和难愈性创面修复的难题,无免疫排斥反应,制备简便,费用低廉,能有效地缩短治疗周期,避免了传统治疗方法效果差及花费高等缺点,具有良好的社会和经济效益,具有广阔的应用前景。