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乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase，简称GLO)是光呼吸代谢的关键酶，近年来越来越多的研究证据表明GLO不仅与参与调控光合作用，且可能在植物抵抗生物与非生物胁迫中起重要作用。生物信息学分析表明水稻基因组中至少有6条可能编码GLO的相似序列，分别位于第三、四、七和八号染色体，根据其在染色体上的位置命名为OsGLO1-OsGLO6，其中OsGLO2和OsGLO6的起始密码子还没有被识别。本研究采用RNA干涉技术和超表达技术来调控水稻GLO基因家族各成员的表达，以期从分子水平深入探讨GLO的生物学功能，主要结果如下： 1.OsGLO1诱导型反义、干涉和超表达载体的构建及其遗传转化 依据OsGLO1的基因序列设计特异引物，通过RT-PCR从水稻叶片的cDNA中扩增得到OsGLO1特异反义、干涉片段和超表达片段。分别将其插入诱导型表达载体pER8，成功构建了诱导型反义、干涉和超表达载体。转化水稻后经潮霉素筛选和PCR检测，确定目的片段已经整合到了水稻基因组中。 2.水稻GLO基因家族各成员与GLO活性的关系 利用本实验室前期已获得的组成型干涉和超表达转基因植株系统研究了GLO基因家族各成员对水稻GLO活性的贡献。当特异干涉各基因时，OsGLO1和OsGLO4干涉植株的GLO活性显著下调，OsGLO3和OsGLO5干涉植株GLO活性与野生型相比却没有显著差异；超表达OsGLO3和OsGLO4时能提高转基因植株GLO活性，而超表达OsGLO5却没有改变GLO活性，尚未成功获得超表达OsGLO1转基因植株。综合上述结果以及其他一些生化证据表明，水稻中GLO活性主要由OsGLO1和OsGLO4所编码的蛋白决定。 3.GLO活性的调控对水稻生长的影响 在自然生长条件下，GLO活性下调的OsGLO1和OsGLO4干涉植株生长发育受到严重抑制，具体表现为植株矮小，根系变短，叶片发黄，生物量降低；而GLO活性上调的OsGLO4超表达植株则相反，对水稻的生长发育具有促进作用，不论是株高、根长或者生物量与野生型相比都有一定优势。表明在水稻中GLO具有重要的作用，高GLO活性是水稻正常生长发育所必不可少的。 4.GLO活性的调控对光合作用的影响 GLO活性的上调并没有引起转基因植株净光合速率的变化，然而当GLO活性下调超过70％后，水稻净光合速率开始下降，活性下调越大，其净光合速率下降越明显。气孔导度也随着净光合速率的下降而下降，但胞间CO2浓度却有所升高，表明净光合速率的下降不是由于气孔关闭而引起。GLO活性的下调导致了乙醇酸的大量积累，但是乙醛酸的含量并没有降低反而升高，且乙醇酸和乙醛酸含量呈极显著线性正相关，暗示可能在其它细胞器(如叶绿体)中存在未知途径氧化乙醇酸形成乙醛酸。进一步分析干涉植株中乙醇酸和乙醛酸的积累量与净光合速率的下降的关系时发现，乙醇酸和乙醛酸含量都与净光合速率呈显著负相关，表明可能由于乙醇酸和乙醛酸的积累导致净光合速率的下降。蛋白质组学分析结果表明，GLO活性下调的干涉植株中Calvin循环途径的关键酶蛋白表达并没有差异。Rubisco活性的测定结果却显示，干涉植株中Rubisco活化态随着净光合速率的下降而下降，推测GLO活性下调抑制光合作用的机理可能是由于乙醇酸和乙醛酸的积累影响了Rubisco的活化所致。Western blot分析进一步确认在干涉植株中Rubisco活化酶(RCA)的蛋白表达量并没有下调，表明对Rubisco活化的抑制不是由于影响了RCA的蛋白表达而引起，而可能是由于影响了RCA催化活性或其它未知的Rubisco活化机理所致。 5.GLO与氧化胁迫及其抗性的关系 随着GLO活性的下调，干涉植株中H2O2含量不但没有降低反而有所提高，而可溶性蛋白和叶绿素含量则显著下降，与此同时伴随着丙二醛含量的升高。蛋白质组学分析结果显示，干涉植株中大量的逆境响应蛋白被诱导。对抗氧化酶系统的活性分析表明，CAT活性随着GLO活性的降低而降低，SOD、POD和GST等的活性却显著提高。推测GLO活性下调的干涉植株中由于Calvin循环受阻导致叶绿体光合电子传递链的过分还原从而引起了氧化胁迫。 超表达植株中随着GLO活性的上调，H2O2、可溶性蛋白和叶绿素含量均上升，但丙二醛含量、CAT、SOD、POD和GST等酶活性没有显著变化，推测H2O2含量的升高是由于GLO活性上升而引起，而此时H2O2含量的升高并没有对转基因植株造成氧化胁迫。进一步研究表明，超表达植株对甲基紫精(MV)诱发的氧化胁迫具有一定抗性，暗示着GLO活性的提高可能增强了植物抗氧化胁迫的能力。 6.GLO与水稻草酸积累的关系 在氨态氮培养条件下，GLO活性的下调反而导致了水稻草酸含量的升高，活性下调越大，草酸含量上升越明显，推测可能是由于干涉植株中乙醛酸含量的升高所致。但在硝态氮培养条件下，干涉植株的草酸含量与野生型相比却没有明显差异。更为意外的是，超表达OsGLO3、OsGLO4和OsGLO5显著降低了销态氮下水稻中草酸含量，其具体调控机理还有待进一步研究。 综上所述，本研究实现了对GLO基因家族各成员的分子调控，表型及生理生化分析表明：OsGLO1和OsGLO4是水稻GLO活性的主要贡献者；GLO对光合作用具有较强的调控作用且可能在植物抵抗氧化胁迫过程中起重要作用。