龙眼（Dimocarpus longan Lour.）属于无患子科龙眼属常绿亚热带果树。龙眼胚胎发育直接影响龙眼果实品质、产量和可食率,因此,龙眼胚胎（种子）发育调控成为生产上迫切需要解决的问题。自然条件下龙眼早期胚胎取样极为困难,且龙眼遗传背景复杂、杂合度高、童期长,阻碍龙眼胚胎发生分子机制研究。植物体胚发生系统在形态发育、生理变化和分子机制上与合子胚发育极为相似,可作为植物胚胎发生分子机制研究的理想实验系统。本研究基于龙眼基因组,结合龙眼体胚发生模式系统、龙眼稳定遗传转化技术和全转录组高通量测序技术,系统挖掘龙眼体胚发生早期差异表达的miRNA,对重要的miR408家族在龙眼体胚发生过程的生物学功能进行深入研究。最终揭示miR408（miR408成熟体）靶向新靶标Dl NUDT23,激活核黄素代谢介导m6A修饰的新分子机制促进龙眼早期体胚发生。本研究可为龙眼及其他植物体胚发生分子机制研究提供新思路,为调控活体胚胎发育提供科学依据。主要研究结果如下:1龙眼体胚发生早期miRNA全基因组鉴定龙眼NEC和体胚发生早期3个阶段（EC,ICp EC,GE）的miRNA转录组数据库,共鉴定到289个已知的miRNA,dlo-miR159a、dlo-miR398b、dlo-miR3932-5p、dlo-miR319a-3p、dlo-miR408-3p/b、dlo-miR319a等在龙眼体胚发生早期上调表达,提示过表达这些miRNA可能促进龙眼球形胚形态建成。GO分析发现木质素代谢途径显著富集,推测细胞壁生物合成在龙眼体胚发生早期发挥重要作用。采用RLM-RACE技术验证了7个细胞壁合成相关miRNA调控靶基因参与龙眼早期体胚发生,其中dlo-miR408-3p靶向切割Dl LAC12。2 dlo-miR408与靶基因在龙眼体胚发生、不同组织部位及非生物胁迫下的表达分析为进一步揭示龙眼体胚发生早期上调表达的miRNA在体胚发生过程的生物学功能。共鉴定到1条pre-miR408序列,4条dlo-miR408成熟体序列（dlo-miR408-3p、b、5p1、5p2）。分子克隆和生物信息学分析法获得pri-miR408,pro-MIR408启动子及靶基因Dl LAC12的序列全长。dlo-miR408-3p、b和dlo-miR408-5p1、5p2均随龙眼体胚发生表达丰度升高。dlo-miR408-3p、b在幼果、成熟果、花药、花蕾和雄花中上调表达。pre-miR408在雌花、败育果中表达较高。且dlo-miR408-3p和dlo-miR408-5p1能响应蔗糖、Cu2+浓度、温度及不同浓度ABA和GA3等非生物胁迫。dlo-miR408的靶基因家族全基因组鉴定,共获得42个Dllaccase（Dl LAC）成员和58个Dl DEAD-box（Dl DDX）成员,均参与龙眼早期体胚发生、不同组织部位及不同品种种子发育。靶基因Dl LAC12蛋白确实定位于细胞壁发挥功能。3 dlo-miR408-3p在龙眼体胚发生早期功能分析及稳定过表达Dl MIR408细胞系获得为进一步了解dlo-miR408-3p在龙眼体胚发生早期的功能,采用miRNA-mimic实验。结果表明dlo-miR408-3p agomir（过表达）和antagomir（抑制表达）处理,dlo-miR408-3p负调控Dl LAC12,促进龙眼球形胚形成和细胞增殖,但对木质素积累无显著影响。推测dlo-miR408-3p-Dl LAC12模型可能不直接调控木质素合成,dlo-miR408-3p还可能参与其他调控机制影响龙眼体胚发生。而mi PEP408一定程度上促进pre-miR408和dlo-miR408-5p1、5p2表达,抑制dlo-miR408-3p、b表达。进一步构建1301:Dl MIR408（Dl MIR408基因）过表达载体,采用龙眼稳定遗传转化技术,转化龙眼EC,通过大量增殖可获得旺盛生长和分化能力强的Dl MIR408-OE过表达纯合球形胚细胞系。但过表达Dl MIR408后,dlo-miR408-5p1显著上调表达,dlo-miR408-3p表达无显著差异。20 mg/L Hyg进行转基因阳性细胞筛选时,再生细胞阳性率达75%。为后续挖掘miR408在龙眼体胚发生早期可能发挥的新分子机制奠定基础。4龙眼过表达Dl MIR408胚性细胞系全转录组分析过表达Dl MIR408转基因细胞系全转录组测序结果表明Dl MIR408-OE与WT两个细胞系共鉴定到114个known miRNA属于73个MIRNA基因家族。Dl MIR408-OE细胞系中85.7%miRNA显著上调表达,其中61.1%为21 nt miRNA,说明过表达Dl MIR408促进21 nt miRNA生物合成。DE miRNA靶基因和m RNA KEGG前20类基因主要富集在核黄素代谢、GPI代谢、牛磺酸与亚牛磺酸代谢、TCA循环、RNA代谢途径、钙离子通道运输、细胞周期调控、生长素代谢等氨基酸代谢和能量代谢。其中Dl NUDT23被预测为dlo-miR408-3p潜在的新靶标。各途径关联分析结果发现过表达Dl MIR408细胞系中嘌呤代谢和磷酸戊糖途径为核黄素生物合成提供GTP和5-磷酸核酮糖,Dl RIBA1、Dl RIBA3和Dlrib5显著上调,Dl PYRR、Dl PYRD和Dl Flavokinase显著下调,阻断氨基酸代谢分支,激活另一磷酸盐代谢支路,促进核黄素生物合成。Dl Flavokinase、Dl NUDT23显著下调,FMN合成减少。另外,MSTRG.7391.1可与dlo-miR408-3p竞争性正调控Dl NUDT23,均显著下调,共同调控FMN合成。由于FMN可作为人工去甲基化酶,调控m6A修饰水平,结合RNA甲基化相关基因“eraser”显著下调,“writer”显著上调,而“reader”显著下调,推测过表达Dl MIR408诱导m6A水平升高。推测过表达Dl MIR408促进磷酸戊糖途径代谢,同时激活核黄素代谢途径,介导m6A修饰调控RNA代谢的稳态,影响龙眼球形胚形态建成。5 Dl MIR408激活核黄素代谢介导m6A修饰促进龙眼早期体胚发生的分子机制验证为验证上述假设,细胞生物学试验结果表明龙眼体胚发生早期各阶段和过表达Dl MIR408细胞系中核黄素含量均显著提高,牛磺酸含量显著下降。细胞形态学观察结果显示,适宜浓度核黄素促进龙眼球形胚膨大和增殖。1.25μM抑制剂DPI抑制球形胚增殖,但可维持球形胚分化,与低浓度核黄素促进龙眼球形胚增殖的结果相反。不同浓度核黄素和DPI处理下基因表达结果显示,Dl NUDT23与dlo-miR408-3p均呈典型的负调控模式。结果证明过表达Dl MIR408抑制Dl NUDT23表达,促进核黄素代谢,促进龙眼体胚早期球形胚发生。此外,为验证过表达MIR408促进m6A修饰水平升高,影响球形胚发生。m6A含量测定结果显示,龙眼体胚发生早期各阶段和Dl MIR408-OE细胞系中m6A水平均升高,说明过表达Dl MIR408促进m6A修饰。不同浓度核黄素和抑制剂DPI处理第11 d时m6A修饰水平呈相反趋势。进一步证明过表达Dl MIR408促进核黄素积累,显著降低FMN水平,提高m6A水平,促进龙眼早期体胚发生。6 dlo-miR408-3p与新靶标Dl NUDT23靶向关系验证为进一步验证dlo-miR408-3p与Dl NUDT23在体内的直接调控关系,构建1301:Dl MIR408和1301:Dl NUDT23过表达载体在烟草叶片和龙眼EC中瞬时转化,结果表明dlo-miR408-3p确实在细胞内靶向降解Dl NUDT23。综上所述,本研究揭示的miR408调控龙眼体胚发生早期的分子机制可能是:体外一些调控因子(mi PEP408、ABA、GA3、2,4-D、蔗糖、Cu2+、温度)能不同程度的影响miR408及其靶基因（Dl LAC、Dl DDX）的表达水平。dlo-miR408主要参与龙眼早期胚胎发育和生殖生长。dlo-miR408在龙眼中还可靶向新靶标Dl NUDT23,调控FMN合成,激活核黄素代谢基因调控网络,调节m6A修饰,进而影响miRNA稳态,最终参与龙眼早期球形胚细胞增殖和分化。为揭示miR408在龙眼体胚发生分子机制研究,乃至植物体胚发生分子机制甚至活体胚胎发育调控提供新思路。