我国烤烟烟碱含量尤其是上部叶烟碱含量偏高的问题十分突出,对烤烟的销售、开发、生产以及人体健康产生严重不利影响。目前采用农艺措施尚不能有效调控烟碱合成,而转烟碱合成酶反义基因工程烟草存在较大的安全性问题。本项目依据RNAi在植物中作用的机制,采用由转烟碱合成关键酶腐胺-N-甲基转移酶(PMT)基因部分序列的发卡dsRNA重组质粒的RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌菌株DY330表达的PMT基因片段的发卡dsRNA,直接用提取的hpRNA根部喷施来降低普通烟草中烟碱的含量。主要研究结果如下:1、构建表达hpRNA的工程菌提取烟草根部总RNA,RT-PCR得到cDNA。以PMT基因序列为模板设计了两对引物,通过酶切、酶连将这两个含有一部分相同序列的片段反向连接到T载体上,测序结果显示其和我们预测的序列相似性99%。将这个反向重复结构连接到表达载体PET21a上,转化到表达菌株中,得到我们所需要的工程菌株。2、工程菌发酵条件的优化工程菌在其OD600=0.5时加入IPTG至最终浓度为0.4mM诱导4h后其提取的hpRNA的含量较高。3、盆栽试验选取盆栽两组长势相同的烟草,一组每隔20天对其根部处理hpRNA,另一组做空白对照。在对照处理后3天,提取RNA,半定量PCR检测PMT基因的表达量与未处理的烟草相比降低。处理两次40天后对对照和处理烟叶烟碱含量测定,测定结果显示烟碱含量降低。4.大田试验选取相同的两块田地,一块处理,一块对照。在烟草进入团棵期第一次处理,每株用10ml菌液提取的hpRNA处理,每隔40天处理一次,一共处理4次。烘烤结束后抽取各部位样品测定其烟碱含量,结果显示烟草不同部位烟碱含量都有所减少,其中中部叶减少的量最大,接近1%。