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1997年香港出现了 H5N1亚型禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）,并引起了人的感染,此后该病毒蔓延到了亚洲、非洲和欧洲等多个国家和地区。截至到 2021年4月已感染了862人,并导致455人死亡（https://www.who.int/influenza/humananimalinterface/H5N1cumulativetable arc hives/en/）。除了H5N1 亚型高致病性禽流感病毒（highly pathogenic influenza virus,HPAIV）外,H7亚型HPAIV也给养殖业和人类的健康带来很大影响。2013年3月,中国上海和安徽省的3名居民感染了 H7N9亚型AIV。据报道,截至2021年4月,H7N9流感病毒已感染1568人,导致616人死亡,病死率较高。（http://www.fao.org/ag/againfo/programmes/en/empres/H7N9/situationupdate.html）。H5N1和H7N9 HPAIV严重威胁养禽业和人类健康,因此需要一种高度安全和有效的疫苗来预防潜在的H5N1或H7N9亚型AIV的大流行。传统的流感疫苗大多以灭活苗为主,主要依赖鸡胚生产,这种灭活苗存在很多缺陷,比如当流感疫情暴发时,鸡胚供应不足,或者引起局部或全身过敏反应,以及免疫反应持续时间短等。因此急需一种安全有效的疫苗来替代传统的灭活疫苗。病毒样颗粒（Virus-like Particles,VLP）不含病毒的遗传物质,由有一种或多种病毒结构蛋白自行组装形成,其结构与天然病毒结构相似。VLP包含了较高密度的病毒表面蛋白,能够像天然病毒一样有效的进入到细胞,具有很好的免疫原性和安全性。此外,VLP的生产不依赖鸡胚,保证了禽流感大流行时疫苗的充足供应并且具有生产周期短和生产成本低等优点。本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统,制备了 H5 VLP疫苗和H5+H7 VLP二联疫苗。攻毒保护试验结果证明两种VLP疫苗免疫SPF鸡均可提供针对H5和H7亚型HPAIV 100%的临床保护,且与市售的商品化疫苗的免疫效果相当,这为H5N1和H7N9禽流感二联疫苗的制备提供了可参考的方法。1.H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的制备与免疫效果评估本研究基于H5N1亚型HPAIV clade 2.3.2.1d TT3株的HA基因构建了重组杆状病毒rBac-TT3-HA,与实验室前期构建的表达H7N9亚型HPAIV NA、M1基因的重组杆状病毒rBac-GD15-NA和rBac-GD15-M1分别以MOI=1共感染Sf9细胞,制备了 H5 VLP。同时以单独表达HA蛋白的重组杆状病毒rBac-TT3-HA制备的灭活疫苗和商品化灭活苗作对照。对4周龄SPF鸡进行单次免疫15 μg的剂量,结果发现所有疫苗组均可诱导宿主产生高效的血凝抑制（HI）抗体、病毒中和（VN）抗体和IgG抗体。用TT3病毒进行攻毒保护试验,发现在14天观察期内各疫苗组的SPF鸡均未出现临床症状和死亡,而PBS对照组的鸡在2天内全部死亡,说明H5 VLP疫苗可以提供针对H5N1亚型HPAIV 100%的临床保护。在攻毒后的第1、3、5、7、9天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行病毒测定,结果显示各疫苗组均没有检测到排毒,而PBS对照组所有鸡均有排毒。同时组织脏器病毒载量测定结果显示,所有疫苗组均可完全抑制病毒在鸡体内的复制。肺脏组织病理切片结果发现,所有疫苗组均有效地减轻了免疫鸡感染病毒后的肺损伤,且以H5 VLP效果最显著。总之,这些结果表明,H5VLP疫苗提供了针对H5N1亚型HPAIV的完全临床保护,并可以完全抑制排毒和病毒在体内的复制,显著减轻肺脏的损伤。因此,本研究研制的H5 VLP为开发新型的H5N1疫苗提供了替代策略。2.H5+H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的构建及免疫效果评估本研究利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统,分别制备了 H5和H7两种VLP,将两种VLP以相同浓度混匀后和佐剂以1:2的比例进行乳化制备H5+H7 VLP二价疫苗,同时以商品化灭活苗作为对照。SPF鸡单次免疫15 μg H5+H7 VLP疫苗和商品化疫苗均可诱导机体产生有效的HI抗体、VN抗体以及IgG抗体。用H5N1和H7N9亚型HPAIV进行攻毒,在14天观察期内疫苗组均没有观察到临床症状和死亡,而H5N1未免疫对照组在2天内全部死亡,H7N9未免疫组在5天内全部死亡,说明H5+H7 VLP疫苗可以提供针对H5N1和H7N9亚型HPAIV 100%的临床保护。在攻毒后的第2、4、6天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行排毒检测,结果显示各疫苗组均没有检测到排毒。此外,组织病毒载量结果显示所有疫苗组均可完全抑制病毒在鸡体内的复制。值得注意的是,与商品化疫苗相比,H5+H7 VLP疫苗能更有效地减轻免疫鸡在感染病毒后的肺损伤程度。总之,这些结果表明,H5+H7 VLP疫苗提供了针对H5N1和H7N9亚型HPAIV100%的临床保护,并可以完全抑制免疫鸡的排毒以及病毒在体内的复制。此外,在减轻病毒感染导致的肺损伤方面,H5+H7VLP优于商品化疫苗。因此,本研究用两种VLP共同乳化的策略制备的二价VLP疫苗为其他多价疫苗的制备提供了的参考。