青钱柳、黄连降血糖活性成分研究

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青钱柳(Cyclocarya paliurus)属于胡桃科青钱柳属,具有祛风止痒、治疗糖尿病、高血压等作用。黄连(Coptis chinensis)是黄连属植物的干燥根茎,在泻火解毒、消渴等方面具有一定效果。青钱柳和黄连在糖尿病治疗中常被配伍使用,为了更好地了解青钱柳和黄连中降血糖的活性成分以及两者活性成分之间的最佳配比,本文进行了相应的探究,具体内容如下:1.青钱柳叶粉碎后用70%乙醇提取,获得得率为24.18%的青钱柳醇提物,乙醇提取结束后加水提取,获得得率为6.02%的青钱柳水提物。将青钱柳醇提物和水提物混合得到青钱柳提取物,经过大孔树脂AB-8分离得到4个组分,利用链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)诱导的糖尿病小鼠探究降血糖活性,发现30%乙醇洗脱部分在空腹血糖(Fasting Blood Glucose,FBG)以及葡萄糖耐量试验(Oral Glucose Tolerance Test,OGTT)上有显著效果(P<0.05)。该部分用MCI、ODS-A柱分离纯化后得到两个单体化合物,通过核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)解析其结构,化合物1为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸-6"-甲酯,化合物2为山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸-6"-甲酯。化合物1和化合物2均能降低小鼠的FBG和OGTT中曲线下面积(Area Under the Curve,AUC)(P<0.05),且化合物1的降血糖作用优于化合物2。在体外酶学研究中,化合物1和化合物2均能使α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性受到抑制,化合物1对两种酶的半抑制浓度(Half Maximal Inhibitory Concentration,IC50)均小于化合物2。化合物1和化合物2对两种酶产生的都是非竞争性抑制,且能产生静态猝灭,与酶之间仅存在着一个结合位点。化合物1、化合物2能使两种酶的二级结构发生变化。氢键是化合物1、化合物2与两种酶之间结合的主要作用力。2.以青钱柳中的总黄酮得率为评价指标对青钱柳的提取工艺进行优化。在单因素实验中,用于提取的溶剂中水和乙醇的体积比应为1:1,料液比为1:20 kg/L,提取温度为70℃,提取时间为3 h。经过响应面优化后得到青钱柳的提取条件为:乙醇浓度为55%,提取温度为70℃,提取时间为3.5 h,得到总黄酮得率为(11.46±0.31)%。优化后的工艺条件能使青钱柳中具有降血糖活性的化合物1和化合物2的高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)峰面积增大,说明优化所得的工艺条件可靠。3.用70%乙醇提取粉碎后的黄连,获得得率为16.38%的黄连醇提物,再用水提取获得得率为8.72%的黄连水提物,两部分混合后即为黄连提取物。黄连提取物经MCI柱分离后进行降血糖活性的筛选,其中95%乙醇洗脱部分降血糖效果较好(P<0.05)。利用ODS-D柱分离得到该部分主要的1个单体化合物:化合物3,化合物3在动物实验中表现出良好的降血糖活性(P<0.01),通过NMR的方法判定其为小檗碱。化合物3对两种酶的抑制作用分别为非竞争性抑制(α-淀粉酶)和竞争性抑制(α-葡萄糖苷酶)。化合物3与两种酶能产生静态猝灭,通过一个结合位点与酶结合,主要存在疏水作用力,与化合物1、化合物2的作用力类型不同,为酶与疏水性化合物的相互作用研究提供参考。4.选取青钱柳叶中降血糖效果更好的化合物1和黄连中具有降血糖作用的化合物3进行不同配比的研究,以糖尿病小鼠的FBG值和AUC值为主要评价指标,得到化合物1和化合物3之间发挥较好降血糖效果时的比例范围为0.4:0.6~0.2:0.8。在该化合物比例条件下,糖尿病小鼠的糖耐量以及灌胃3周后的空腹血糖情况优于两个单一化合物组。化合物1和化合物3在0.4:0.6~0.2:0.8的配比范围内,可改善对糖尿病小鼠的血脂情况、肝脏抗氧化酶和氧化应激指标、糖化血红蛋白(Hemoglobin A1c,Hb A1c)和胰岛素抵抗。综上,本文分别从青钱柳中提取得到化合物1和化合物2,从黄连中提取得到化合物3,化合物1~3均有降血糖活性。化合物1和化合物3配伍后可表现出优于单一化合物的降血糖效果。本研究可为从天然资源中分离出降血糖活性成分以及为青钱柳和黄连的配伍提供参考。
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