恶性肿瘤严重危害人类健康，据统计2012年全世界约有1400万新增癌症病例，820万癌症死亡病例，其中，肺癌死亡病例为159万，占死亡病例的19.4％。2014年全国肿瘤登记中心发表的统计数据显示，所有新发恶性肿瘤中肺癌居首位，占恶性肿瘤新发病例的19.59%，死亡率占恶性肿瘤死因的24.87%。　　（1,2-二氨基环己烷）二氯化铂(DACHPt)是一种顺铂的类似物，比顺铂毒性低且与顺铂无交叉耐药性。透明质酸(HA)是天然可降解的高分子材料，它是细胞间质的重要组成成分，可被淋巴系统所清除，透明质酸可以作为药物载体将药物递送到肿瘤组织中。聚乙二醇(PEG)亲水性强，是形成胶束应用较为广泛的亲水嵌段，可促进胶束对铂类药物的溶解。单甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰的HA和 DACHPt所形成的靶向纳米胶束系统(mPEG-HA-Pt)由于增强渗透滞留效应(Enhanced Permeability and Retention Effect,EPR effect)而能够实现体内长循环，增加药物在肿瘤部位的高浓度聚集，降低对正常组织的毒副作用。本研究主要实验方法和结果：　　1.mPEG-HA的合成　　HA在pH7.4的PBS缓冲液中经EDC/NHS的催化作用下，室温活化2小时。按一定比例滴入mPEG-NH2，室温下继续反应24小时。反应产物经截留分子量(MW8kDa)的透析袋透析纯化48小时。冷冻干燥后制成mPEG-HA产物。　　2.mPEG-HA的表征　　通过傅里叶变换显微镜红外光谱(FT-IR)分析和核磁共振氢谱(1H NMR)分析进行mPEG-HA的结构表征。核磁共振图谱中(-OCH2CH2-:δ=3.72 ppm)为mPEG亚甲基的积分面积，(-COCH3:δ=2.02 ppm)为HA中甲基的积分面积，mPEG的取代度通过比较两者的积分面积获得。红外图谱显示，1736 cm?1处为OHC-PEG-CHO基团的C-O伸缩振动峰，1728 cm?1处为Gal-PEG-CHO基团的C-O伸缩振动峰,1060cm?1为C-N伸缩振动峰，说明HA成功接上了mPEG。　　3.DACHPt靶向纳米胶束的制备　　DACHPt在超声条件下混悬于去离子水中，然后加入一定量的AgNO3，避光反应24小时，形成DACHPt的混合溶液。然后将混合溶液在3000rpm转速下离心10分钟，去掉AgCl沉淀，最后产物用0.22μm的微孔滤膜过滤。取一定量不同取代度的mPEG-HA，加入DACHPt溶液中，所得混合溶液避光搅拌反应120小时。经超滤(MW100KDa)去除游离的DACHPt，最后制备得到DACHPt靶向纳米胶束。　　4.DACHPt靶向纳米胶束的表征　　制备得到的DACHPt靶向纳米胶束进行动态光散射和zeta电位分析。DACHPt靶向纳米胶束的粒径范围为70-100nm，平均粒径为86nm，随着PEG的取代度从0%到5%，靶向纳米胶束粒径逐渐降低。　　5.透射电子显微镜观察DACHPt靶向纳米胶束的形态　　通过透射电子显微镜观察的DACHPt靶向纳米胶束的形态呈球形，且大小分布均匀（＜100nm），可以说明mPEG-HA合成产物和DACHPt形成了具有核壳结构的靶向纳米胶束。　　6.ICP-MS法测定DACHPt靶向纳米胶束的包封率和载药量　　DACHPt靶向纳米胶束中铂的含量通过离子电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS法,Agilent7700s,USA)测得。DACHPt靶向纳米胶束的载药量和包封率分别为（19±0.24）%和（86±1.6）%。　　7.体外药物释放实验　　DACHPt靶向纳米胶束溶液密封放入透析袋中(MW8000KDa)测定体外药物释放量。实验结果表明，DACHPt显示出从纳米粒中持续释放的行为，并且DACHPt的释放过程分为两个阶段，前4小时的突然释放，随后24小时的持续缓慢释放。随着PEG取代度的增加，DACHPt的释放速率略微降低。　　8.DACHPt靶向纳米胶束的体外细胞毒性实验　　A549细胞以83103cells/well加入96孔板，分别加入培养液（阴性对照）、系列浓度的mPEG-HA溶液、DACHPt溶液（阳性对照组，用PBS溶解）、系列浓度的DACHPt靶向纳米胶束溶液做MTT测定试验。不同取代度的mPEG-HA对A549细胞的增长抑制作用没有显著性差异。不同取代度的DACHPt靶向纳米胶束对A549细胞的增长抑制作用没有显著性差异。不同浓度的DACHPt靶向纳米胶束对A549细胞的生长有显著性差异。各浓度组药物分别作用48小时后，对细胞生长抑制作用结果表明，细胞存活率与药物浓度呈反比，有明显的剂量依赖性，DACHPt靶向纳米胶束（取代度为2%）48小时时的细胞生长抑制作用较为明显。在剂量为1～100μg/mL范围内，DACHPt阳性对照组和DACHPt靶向纳米胶束组与空白对照组和 mPEG-HA空白胶束组相比，细胞增长抑制作用有显著性差异；剂量为0.01～100μg/mL范围内，DACHPt阳性对照组与DACHPt靶向纳米胶束组相比，细胞增长抑制作用没有显著性差异。　　9.肺原位移植瘤模型建立　　裸鼠左肺注入A549LUC细胞，建立肺原位移植瘤模型。　　10.活体生物发光法评价A549LUC原位移植瘤模型的建立　　腹腔注射荧光素酶底物，检测小鼠肿瘤生物发光情况。正常裸鼠检测生物发光结果无荧光信号；A549LUC细胞原位接种后肺部生物发光检测结果显示左肺有强荧光信号，而且转移至头部及右下肢，LUC基因表达正常，证明成功建立了A549LUC原位移植瘤模型。　　11.裸鼠肺组织切片HE染色　　将裸鼠处死后，取肺脏，以包音氏固定液固定24小时，之后送检HE染色切片，光镜下观察肿瘤组织病理形态及结构变化。正常肺泡间可见恶性细胞集团，呈腺腔样排列，部分腺体相互融合呈筛状，细胞可见异型性，核分裂明显，和增大可见核仁，核浆比增大，间质见少量炎症细胞浸润及见少量血管。　　12.DACHPt靶向纳米胶束对裸鼠皮下移植瘤生长的影响　　BALB/c裸鼠15只，雄性，体重16-18g左右时皮下给药，当肿瘤体积到达120mm3时，将动物随机分为三组，每隔一天静脉注射给药一次，保证给药剂量为4 mg单位DACHPt/kg小鼠体重，共给药4次。裸鼠体重阳性对照组与DACHPt靶向纳米胶束组间比较差异无统计学意义，但模型组与阳性对照组、DACHPt靶向纳米胶束组相比，具有显著性差异。肿瘤体积阳性组和DACHPt靶向纳米胶束组的肿瘤体积虽上升，但与模型组的肿瘤体积上升趋势相比，其上升幅度明显减少，均有显著性差异。　　研究结论：　　1.本实验所制备的基于PEG化HA的DACHPt靶向纳米胶束经红外光谱及核磁共振谱分析，确定了其结构。透射电镜下胶束形态呈球形，且分布均匀，体外药物释放实验显示其长效的药代动力学特点。　　2.DACHPt靶向纳米胶束显著改善了 DACHPt的难溶性问题，胶束粒径小于100nm，可直接静脉给药。　　3.MTT体外细胞增长抑制试验显示，DACHPt靶向纳米胶束具有明显抑制人非小细胞肺癌A549细胞的增殖作用。　　4.通过活体生物发光法证实成功建立了A549LUC原位移植瘤模型。　　5.体内抑瘤实验结果表示，DACHPt靶向纳米胶束对人非小细胞肺癌 A549细胞移植瘤具有明显的体内抑瘤作用及低的毒副作用。