背景再生障碍性贫血（再障aplastic anemia,AA）是由多种原因引起的一种骨髓衰竭综合征。骨髓血细胞生成减少导致粒细胞、网织红细胞、单核细胞以及血小板均减少,临床表现为不同程度的贫血、出血和感染。目前公认,AA是T细胞介导的自身免疫性疾病。AA患者体内存在辅助性T细胞0（helper T lymphocyte 0,Th0）向辅助性T细胞1（helper T lymphocyte 1,Th1）极化和辅助性T细胞2（helper T lymphocyte 2,Th2）相对减少的免疫异常现象,导致Th1/Th2细胞比例失衡并向Th1细胞偏移,进而出现细胞免疫亢进、自身免疫被打破。这一变化可能与异常激活的T细胞分泌的细胞因子如白介素12（interleukin 12,IL-12）、干扰素γ（interferon-γ,IFN-y）等抑制骨髓造血干细胞的增殖分化有关。Th1细胞以分泌IFN-γ为特征,介导细胞免疫;Th2细胞以分泌IL-4为代表,参与体液免疫。本实验通过观察IFN-γ、IL-4的蛋白表达情况来间接观察AA患者体内Th1、Th2细胞的免疫状态。B细胞来源于造血干细胞,在骨髓成熟、次级淋巴器官激活,合成并分泌抗体,介导体液免疫。活化的B细胞表达多种细胞因子受体（cytokine receptor,CKR）、分泌多种细胞因子、参与抗原呈递、活化T细胞共同参与疾病免疫调节导致免疫紊乱。B细胞根据功能可分为效应性B细胞和调节性B细胞（regulatory B cells,Breg）。Breg细胞是类似于调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）的具有免疫抑制功能的一组特殊B细胞亚群。Breg细胞主要通过分泌细胞因子IL-10、转化生长因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）发挥免疫调节作用,影响其他免疫细胞,抑制过强的免疫应答,维持免疫耐受。Breg细胞中IL-10的表达与STAT家族磷酸化改变有关,在系统性硬化病中Breg细胞的缺乏与STAT3受损密切相关,进一步证明了Breg细胞分泌IL-10依赖STAT3的磷酸化。IL-10是一具有多种生物活性的免疫抑制因子,具有抑制CD4+T细胞增殖分化及分泌IFN-γ、抑制Th1和Th2细胞向两极分化、诱导T细胞分化为Treg细胞及分泌IL-10的免疫调节功能。TGF-β通过抑制骨髓造血细胞、抑制T细胞和B细胞的增殖、抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的分化、抑制IFN-γ等炎性细胞因子的产生、诱导Treg细胞的分化及分泌细胞因子发挥免疫调节作用。另一方面Breg细胞可通过细胞间作用影响Treg细胞数量及功能而发挥免疫调节作用。在多种免疫系统疾病中Breg细胞的数量和功能均有不同程度减低,如强制性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）、免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia,ITP）、慢性移植抗宿主病（chronic graft-versus-host disease,cGVHD）等。同为自身免疫性疾病的AA,Breg细胞在其发生发展中的作用及免疫调节机制如何?Breg细胞在AA患者体内发生怎样的变化及与其他免疫细胞的关系如何?为研究Breg细胞在AA发生发展中的作用,本研究首先分析了 AA患者骨髓及外周血中IL-10+CD19+Breg细胞亚群、TGF-β+CD19+Breg细胞亚群的变化;通过检测IL-10、TGF-β基因及蛋白水平表达情况,分析Breg细胞在AA患者体内的功能状态;通过分析与外周血反映骨髓增生程度相关临床指标（中性粒细胞计数、网织红细胞计数、血小板计数）的相关性,进而评估Breg细胞与AA疾病病情严重度程度及治疗预后转归的关联性。探讨Breg细胞在AA发病机制中的作用及临床意义,为AA的免疫治疗提供新的观点及方向。IL-9是一种单链糖蛋白,分子量为14kDa,是γ家族受体成员之一,主要由T细胞分泌,如Th2、Th9、Th17、Treg细胞等。IL-9与效应细胞上的白介素9受体（interleukin 9 receptor,IL-9R）结合后发挥免疫调节作用,与TGF-β协同诱导幼稚CD4+T细胞分化成Th17细胞,可增强Foxp3+Treg细胞的逆转录抑制功能。当IL-9与IL-9R结合时可通过激活JAK中的JAK1、JAK3相互磷酸化,促使STAT磷酸化,特别是STAT3磷酸化,之后它们移至细胞核以激活IL-9诱导的基因的表达,从而发挥影响细胞的增殖与凋亡作用。多项研究提示IL-9对免疫系统具有双向调节作用,不同情况下对各种疾病的抑制或促进作用各异。在实验性自身免疫性脑脊髓膜炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）的小鼠模型中,提示IL-9具有抑制EAE发病的作用;在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）、系统性硬化病（systemic sclerosis,SSc）患者体内 IL-9含量明显高于健康对照组,提示IL-9具有促进疾病发生发展的作用。既然IL-9在上述自身免疫性疾病的发生发展中具有一定的促进作用,那么对作为自身免疫性疾病的AA的发生发展作用如何呢?本研究应用酶联免疫吸附实验（ELISA）、实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白印记分析（Western blot）技术检测AA患者外周血、骨髓中IL-9与IL-9R在基因及蛋白水平的表达情况,分析IL-9、IL-9R与AA患者体内反映骨髓增生程度的各临床特征之间的相关性。探讨IL-9、IL-9R在AA发病机制中的作用及临床意义,为基于IL-9的靶向治疗提供理论依据。第一部分调节性B细胞在再生障碍性贫血患者中的变化及临床意义目的:研究AA患者体内Breg细胞亚群分布与健康人群间的差异及与反映骨髓增生程度临床指标的相关性,探讨Breg细胞亚群在AA患者体内的功能,尝试发现Breg细胞在AA发生发展中的作用及临床意义。材料与方法:1.研究对象选取:选取初诊AA患者共40例包括16例重型再生障碍性贫血（重型再障severe aplastic anemia,SAA）、24例非重型再生障碍性贫血（非重型再障 non-severe aplastic anemia,NSAA）、治疗后再生障碍性贫血（Remission）20例及健康志愿者（Control）20例,收集入组研究对象的骨髓及外周血各5-10 ml。2.单个核细胞提取及细胞培养:采用密度梯度离心原理提取骨髓及外周血中的单个核细胞,计数后于含10%小牛血清的1640培养基中调整细胞浓度为1-2×106/ml。加入25 ng/mL佛波酯（联科生物公司）、0.5μg/mL离子霉素（联科生物公司）、0.5μL/mL Brefeldin A（联科生物公司）（PIB）,再加入5μg/mL CpG（ODN 7909 Invivogen）、0.5 μg/mL CD40L（RD公司）在5%CO2 37℃孵育箱内孵养共刺激培养5小时;收集骨髓上清和血清。3.Breg细胞亚群检测:采用流式细胞免疫荧光术、细胞免疫荧光术分别检测IL-10+CD19+Breg细胞亚群、TGF-β+CD19+Breg细胞亚群在SAA、NSAA、Remission、Control组骨髓及外周血单个核细胞中的表达。4.细胞因子（IL-10、TGF-β）基因水平检测:采用RT-PCR技术检测IL-10、TGF-β在SAA、NSAA、Remission、Control组骨髓及外周血单个核细胞中mRNA水平的表达。5.细胞因子（IL-10、TGF-β、INF-γ、IL-4）蛋白水平检测:采用ELISA技术检测IL-10、TGF-β、INF-γ、IL-4在SAA、NSAA、Remission、Control组骨髓上清及血清中蛋白水平的表达。6.临床评价:完整的病史,体格检查,采集4组研究对象的晨起空腹外周血用血常规分析仪检测中性粒细胞计数、血小板计数、网织红细胞计数。7.统计分析:所有结果均采用SPSS 21.0软件包进行统计学分析。结果:1.骨髓:SAA、NSAA、Remission、Control组的CD19+B细胞占单个核细胞的百分比四组依次为（7.62±3.54%、6.95±2.61%、7.62±1.98%、7.11 ±2.13%）,统计学分析示:SAA、NSAA、Remission组分别与Control组相比无明显升高和降低（P>0.05）,SAA、NSAA组与Remission组相比无明显升高和降低（P>0.05）。2.外周血:SAA、NSAA、Remission、Control组的CD19+B细胞占单个核细胞的百分比四组依次为（6.84±2.67%、7.32±2.49%、7.12±2.92%,8.17±3.35%）,统计学分析示:SAA、NSAA、Remission组分别与Control组相均降低（P>0.05）,SAA、NSAA组与Remission组相比无明显升高和降低（P>0.05）。3.骨髓:SAA、NSAA、Remission、Control组的IL-10+CD19+Breg细胞亚群占CD19+B细胞的百分比四组依次为（0.55±0.17%、1.39±0.41%、2.99±0.72%、3.28±1.04%）,TGF-β+CD 19+Breg细胞亚群占CD 19+B细胞的百分比四组依次为（1.16±0.26%、2.49±0.90%、4.80±1.04%、5.42±1.08%）,统计学分析示:SAA组 VS Control组显著减低（P<0.001）,NSAA组 VS Control组显著减低（P<0.001）,SAA组 VS Remission组显著减低（P<0.001）,NSAA组 VS Remission组显著减低（P<0.001）,SAA组 VS NSAA组减低（P<0.05）。4.外周血:SAA、NSAA、Remission、Control组IL-10+CD19+Breg细胞亚群占CD19+B细胞的百分比四组依次为（0.65±0.19%、1.54±0.40%、2.97±0.69%、3.33±0.85%）,TGF-β+CD 19+Breg细胞亚群占CD19+B细胞的百分比四组依次为（0.98±0.20%、2.71±0.79%、4.16±1.27%、4.64±1.27%）,统计学分析示:SAA组 VS Control组显著减低（P<0.001）,NSAA组 VS Control组显著减低（P<0.001）,SAA组 VS Remission组显著减低（P<<0.001）,NSAA组 VS Remission组显著减低（P<0.001）,SAA组VS NSAA组减低（P<0.05）。5.骨髓:SAA、NSAA、Remission、Control组的单个核细胞中IL-10的mRNA表达四组依次为（0.54±0.12、0.57±0.14、0.92±0.11、1±0.15）,TGF-β的mRNA表达四组依次为（0.54±0.10、0.69±0.16、0.89±0.21、1±0.16）;外周血:SAA、NSAA、Remission、Control组单个核细胞中IL-10的mRNA表达依次为（0.48±0.08、0.56±0.13、0.92±0.13、1±0.12）,TGF-β的mRNA表达四组依次为（0.46±0.14、0.59±0.18、0.92±0.15、1±0.15）,统计学分析示:统计学分析示:SAA组 VS Control组显著减低（P<0.001）,NSAA组 VS Control组显著减低（P<0.001）,SAA组VS Remission组显著减低（P<0.001）,NSAA组 VS Remission组显著减低（P<0.001）,SAA组 VS NSAA组减低（P<0.05）。6.骨髓上清:SAA、NSAA、Remission、Control组中IL-10的蛋白水平表达四组依次为（19.77±6.23 ng/mL、23.69±4.48 ng/mL、55.86±8.22 ng/mL、61.12±9.67 ng/mL）,TGF-β的蛋白水平表达四组依次为（34.99±6.35 ng/mL、42.40±12.00 ng/mL、77.71±9.79 ng/mL、85.01±14.00 ng/mL）;外周血清:SAA、NSAA、Remission、Control组中IL-10的蛋白水平表达四组依次为（22.27±5.86 ng/mL、26.45±5.19 ng/mL、57.20±12.80 ng/mL、63.30±11.01 ng/mL）,TGF-β的蛋白水平表达四组依次为（36.13±6.40 ng/mL、41.88±8.55 ng/mL、68.23±12.40 ng/mL、71.96±14.93 ng/mL）,统计学分析示:SAA组VS Control组显著减低（P<0.001）,NSAA组VS Control组显著减低（P<0.001）,SAA组VS Remission组显著减低（P<0.001）,NSAA组 VS Remission组显著减低（P<0.001）,SAA组 VS NSAA组减低（P<0.05）。7.骨髓上清:SAA、NSAA、Remission、Control组中IFN-γ/IL-4比值四组依次为（3.03±0.62、2.39±0.53、1.40±0.21、1.28±0.15）;外周血清:中IFN-y/IL-4比值四组依次为（2.81±0.45、2.35±0.54、1.37±0.24、1.26±0.13）,统计学分析示:SAA组VS Control组显著升高（P<0.001）,NSAA组VS Control组显著升高（P<0.001）,SAA组 VS Remission组显著升高（P<0.001）,NSAA组 VS Remission组显著升高（P<0.001）,SAA组VS NSAA组升高（P<0.05）。8.SAA、NSAA组骨髓及外周血中IL-10+CD19+Breg细胞亚群、TGF-β+CD1 9+Breg细胞亚群与AA反应骨髓增生程度相关临床指标（中性粒细胞计数、网织红细胞计数、血小板计数）分别呈正相关（P<0.05）,而Remission组则无明显相关性（P>0.05）。结论:1.AA患者CD 19+B细胞占单个核细胞的比例较健康对照组无显著性差异。2.骨髓及外周血中SAA、NSAA组Breg细胞（IL-10+CD19+Breg细胞亚群、TGF-β+CD19+Breg细胞亚群）占CD19+B细胞的比例较Remission、Control组显著性降低,SAA组较NSAA组降低,且与外周血反映骨髓增生程度的临床指标呈正相关;IL-10、TGF-β在基因及蛋白水平均较Remission、Control组显著性降低,SAA组较NSAA组降低,提示Breg细胞在AA的发生发展、疾病病情严重程度及预后转归中可能起一定的作用。3.AA患者骨髓及外周血中INF-y/IL-4较Remission、Control组显著升高,进一步证实AA患者体内存在Th1/Th2细胞比例失衡的细胞极化现象。第二部分IL-9/IL-9R在再生障碍性贫血患者中的变化及临床意义目的:研究AA患者骨髓及外周血中IL-9、IL-9R在基因及蛋白水平的表达及与反映骨髓增生程度临床指标（中性粒细胞计数、网织红细胞计数、血小板计数）的相关性;探讨IL-9、IL-9R在AA发病机制中的作用及临床意义,为基于IL-9的免疫治疗提供理论依据。材料与方法:1.研究对象选取:选取初诊AA患者共40例包括16例SAA、24例NSAA、Remission及Control各20例,收集入组研究对象的骨髓及空腹外周血各5-10 ml。2.单个核细胞提取:采用密度梯度离心原理提取骨髓及外周血中单个核细胞,并提取单个核细胞中的cDNA和蛋白;同时收集骨髓上清和血清并于-80℃冻存。3.采用ELISA技术检测AA患者骨髓上清及血清中IL-9蛋白水平的表达,检测结果与反映骨髓增生程度的相关临床指标行相关性分析。4.采用RT-PCR、Western blot技术检测IL-9、IL-9R在AA患者骨髓及外周血单个核细胞中基因及蛋白水平的表达,检测结果与反映骨髓增生程度的相关临床指标行相关性。5.统计分析:所有结果均采用SPSS 21.0软件包进行统计学分析。结果:1.IL-9在SAA、NSAA、Control组骨髓上清中蛋白表达三组依次为（2.48±0.56 ng/mL、2.25±0.32 ng/mL、1.28±0.40 ng/mL）,统计学分析示:SAA组 VS Control组升高（P<0.05）,NSAA组VS Control组升高（P<0.05）,SAA组VS NSAA组升高（P>0.05）,与反应骨髓增生程度相关指标呈负相关（P<0.05,r<0）。2.IL-9在SAA、NSAA、Control组血清中蛋白表达三组依次为（3.15±0.39 ng/mL、3.01±0.46 ng/mL、1.18±0.50ng/mL）,统计学分析示:SAA组 VS Control组升高（P<0.05）,NSAA组VS Control组升高（P<0.05）,SAA组VS NSAA组升高（P>0.05）,与反应骨髓增生程度相关指标呈负相关（P<0.05,r<0）。3.IL-9在SAA、NSAA、Control组骨髓单个核细胞中mRNA表达三组依次为（1.88±0.21、1.81±0.28、1.0±0.13）,IL-9R在上述三组骨髓单个核细胞中mRNA表达依次为（1.73±0.19、1.62±0.26、1.0±0.17）;IL-9在SAA、NSAA、Control组三组骨髓单个核细胞中蛋白水平表达依次为（2.38±0.27、1.84±0.02、1.0±0.16）,IL-9R在上述三组骨髓单个核细胞中蛋白水平表达依次为（2.96±0.22、2.13±0.10、1.0±0.04）。统计学分析示:SAA组 VS Control组升高（P<0.05）、NSAA组 VS Control组升高（P<0.05）,SAA组VSNSAA组升高（P>0.05）,与反应骨髓增生程度相关指标呈负相关（P<0.05,r<0）。4.IL-9在SAA、NSAA、Control组外周血单个核细胞中mRNA表达三组依次为（1.52±0.33、1.44±0.35、1.0±0.14）,IL-9R在上述三组外周血单个核细胞中mRNA表达依次为（1.66±0.18、1.55±0.22、1.0±0.15）;IL-9在SAA、NSAA、Control组外周血单个核细胞中蛋白水平表达三组依次为（3.23±0.08、2.12±0.25、1.0±0.16）,IL-9R在上述三组外周血单个核细胞中蛋白水平表达依次为（3.63±0.18、2.38±0.20、1.0±0.03）。统计学分析示:SAA组 VS Control组升高（P<0.05）、NSAA 组VS Control组升高（P<0.05）,SAA组 VS NSAA组升高（P>0.05）,与反应骨髓增生程度相关指标呈负相关（P<0.05,r<0）。结论:5.AA患者骨髓上清及外周血清中IL-9蛋白水平升高,SAA组升高更显著,与反映骨髓增生程度的临床指标呈负相关。6.AA患者骨髓及外周血单个核细胞中IL-9、IL-9R在基因及蛋白水平含量较健康对照明显升高,SAA组升高更显著,与反映骨髓增生程度的临床指标呈负相关。7.IL-9、IL-9R的异常表达与AA发生及疾病程度的严重性之间存在一定关联。补充:如我们所阐述,Breg细胞分泌IL-10与STAT3磷酸化密切相关;IL-9与IL-9R结合后发挥相应的生物学作用亦与STAT3磷酸化相关,提示Breg细胞与IL-9在发挥免疫调节作用时可能存在关联。在本课题中,我们进行了 Breg细胞亚群与IL-9、IL-9R的相关性分析,发现无明显的关联,考虑与本实验样本量较少有关,后续我们将扩大样本量,用于验证Breg细胞及IL-9/IL-9R与AA发生发展的关系如何。