自然界的植物经常会遭受干旱、盐碱和低温等恶劣环境的胁迫危害,使其生长发育受到抑制,其至导致植株死亡。这些非生物胁迫造成的危害已经成为农业增产、生态环境改良、实现可持续发展的重要限制因素。因此,阐明植物对环境胁迫信号的应答机制,应用基因工程手段提高植物的抗逆性,以满足日益增长的人口对粮食的需求,已成为未来农业发展的关键和基础性工作。为了进一步深入研究植物抗逆性的分子机制,获得具有自主知识产权的优良抗逆基因,我们利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术快速克隆了一个基因和两个特异的cDNA片段,用于植物抗逆性和遗传工程研究。 DREB(dehydration responsive element binding protein)是一类与逆境胁迫相关的转录因子,它能够识别并结合于与干旱、高盐及低温胁迫应答有关基因启动子区域中的DRE(dehydration responsive element)顺式作用元件,启动下游抗逆基因的表达,从而在转录水平上调控多个抗逆基因。因此,DREB类转录因子能够综合改良植物的抗逆性状,是迄今为止较为理想的抗逆工程基因。我们采用RACE的方法,首次从早熟禾中成功分离了PpDREB2基因和两段低温诱导编码DREB蛋白的cDNA序列。PpDREB2的cDNA序列全长833bp,含有一个完整的开放阅读框架,编码264个氨基酸,氨基酸序列分析表明PpDREB2含有一段核定位信号(NLS)、酸性活化区域(AAR)和63个氨基酸的DNA结合域(EREBP/AP2),属于EREBP/AP2基因家族。PpDREB2基因在基因组DNA的结构分析证明,PpDREB2没有内含子。利用RT-PCR对PpDREB2基因进行组织特异性表达检测,结果分析表明PpDREB2基因在茎和叶中高水平表达,而在根中表达较弱。在逆境条件下的表达模式分析表明,PpDREB2基因在转录水平的表达受高盐和干旱强烈诱导,而与低温和ABA诱导没有关系。上述结果表明PpDREB2基因可能通过与ABA信号传导无关的途径来提高植物对干旱、盐碱和低温胁迫的耐性。Southern杂交分析显示,PpDREB2在早熟禾基因组中有三个拷贝。两段低温诱导的编码DREB蛋白的cDNA序列分别为598 bp和296bp,其中有176 bp的重叠序列。 此外,构建了含有PpDREB2基因、gus基因和PPT乙酰转移酶基因(bar)的植物表达载体p3301-BI121-PpDREB2,其中,CaMV35S启动子调控PpDREB2基因的表达,应用农杆菌介导法将p3301-B1121-PpDREB2导入水稻,获得了15株阳性植株。 上述结果为进一步研究早熟禾的抗逆性机制以及应用基因工程手段改良农作物的抗逆性奠定了基础。