尽管近代医学在抗生素使用和疫苗接种方面有着长足进步,脑膜炎的全球疾病负担在当前仍然很重,脑膜炎防治进展也远远落后于其他疫苗可预防的疾病。据报道在2016年全球脑膜炎发病近三百万例,造成数十万病患死亡。细菌性脑膜炎被认为是该疾病的最严重形式,其发病急,起病重,可导致患者出现死亡或严重后遗症。细菌性脑膜炎多由细胞外病原菌引起,且大多数病例都并发有菌血症。本研究关注于血源性细菌性脑膜炎发病的一个关键环节,即细菌如何突破血液与中枢神经系统之间的屏障而进入脑部。细菌穿过血液与中枢神经系统之间屏障的经典途径有三种:跨细胞模式、细胞旁模式和“特洛伊木马”模式。这些途径并非相互排斥,研究显示脑膜炎奈瑟球菌等致病菌可能通过多种途径从血液循环系统中侵入中枢神经系统。作为血液与中枢神经系统之间的重要天然屏障,血脑屏障不仅会阻隔病原体的入侵,也会阻碍治疗性药物的入脑。其中,一些研究显示,细胞外腺苷可以通过激活存在于脑微血管内皮细胞表面上的A1和A2A腺苷受体而改变血脑屏障通透性,该机制可应用于跨血脑屏障药物递送。另一方面,我们实验室前期工作从猪链球菌血清2型的胞壁蛋白中鉴定了一种5′-核苷酸酶（Ssads）,该酶能够水解AMP、ADP、ATP水解而产生腺苷。猪链球菌血清2型在感染人类后可引发脑膜炎和链球菌中毒休克血症,并且是亚洲部分地区脑膜炎的主要致病菌。尽管存在着这些线索,目前尚未有病原菌腺苷合成酶促进菌体穿过血脑屏障的机制研究报道。在本研究第一部分中,我们旨在探讨腺苷合成酶Ssads在猪链球菌穿过血脑屏障过程中发挥的功能以及具体细胞分子机制。利用实验室近期优化的猪链球菌脑膜炎小鼠动物模型,研究发现感染腺苷合成酶基因缺陷猪链球菌（S.suisΔssads）的小鼠在感染后72h时脑中细菌载量明显低于野生型猪链球菌（S.suisWT）感染的小鼠,而它们在感染后5h和72h时血液中的细菌载量未见明显区别。对小鼠脑组织切片进行病理学分析发现,ssads基因缺陷使猪链球菌引发小鼠脑组织中脑膜增厚、出血和炎性细胞浸润的能力减弱。在以人脑微血管内皮细胞HCMEC/D3细胞系构建的体外血脑屏障模型上,我们发现腺苷合成酶介导的腺苷生成能够促进猪链球菌穿过HCMEC/D3细胞单层,但不会显著影响猪链球菌对HCMEC/D3细胞的黏附侵袭率。我们使用A1、A2A、A2B腺苷受体拮抗剂进行筛选实验,发现A1、A2A受体信号在猪链球菌穿透体外人血脑屏障过程中发挥重要作用。接下来细胞内cAMP测定实验以及A1腺苷受体激动剂、竞争性cAMP拮抗剂实验的结果均支持,A1腺苷受体级联信号的激活促进了猪链球菌穿过体外血脑屏障。我们使用由CRISPR技术编辑的HCMEC/D3细胞,A1腺苷受体激动剂/拮抗剂给药的小鼠以及CRISPR-CAS9技术构建的基因敲除小鼠进行实验,验证了Ssads的酶活性和A1腺苷受体信号传导对猪链球菌穿过血脑屏障的促进作用。此外,利用从小鼠脑组织分离的原代脑微血管内皮细胞进行荧光共聚焦实验及初步蛋白免疫印迹实验,我们发现腺苷合成酶介导腺苷生成或者A1腺苷受体信号可能促进了猪链球菌感染引起脑微血管内皮细胞的细胞骨架重排以及连接蛋白变化,并可能与MAPK途径信号分子中的ERK1/2蛋白及p38蛋白磷酸化相关。这部分的研究数据说明猪链球菌能够利用腺苷合成酶催化产生细胞外腺苷来促进其穿过血脑屏障。在本研究的第二部分中,我们探讨其他具有腺苷合成酶活性的病原菌是否也能利用催化产生细胞外腺苷来辅助脑膜炎疾病发生。我们通过序列比对及文献检索收集了具有腺苷合成酶基因的革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌信息,并借助MEGA软件（7.0）以最大似然法在“WAG+G+I+F”模型下对22个已识别或预测5′-核苷酸酶蛋白序列进行了系统进化学分析。利用磷酸根检测试剂盒,我们验证了多种致脑膜炎病原菌（包括B族链球菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌）具有菌体暴露的腺苷合成酶活性,而肺炎链球菌不具备这种暴露的酶活性。接下来,我们评价5′-核苷酸酶抑制剂APCP对B族链球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌穿过HCMEC/D3单层能力的影响,发现这三种细菌都可以穿过单层细胞屏障,而添加APCP会显著降低这些细菌穿过血脑屏障的能力。此外,我们实验室分离鉴定一株荚膜血清3型、MLST分型17型的B族链球菌,我们进一步探索了腺苷合成在B族链球菌进入小鼠脑部过程中的作用。借助定义明确且应用广泛的血源性B族链球菌脑膜炎小鼠模型,我们发现抑制5′-核苷酸酶活性可以抑制腺苷合成而显著降低感染后72h时小鼠脑中细菌载量。综合这部分研究数据显示,其他类似的致脑膜炎病原菌也可能通过合成细胞外腺苷来改变血脑屏障通透性从而促进细菌入侵中枢神经系统。