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本文以一株啤酒工业酿造酵母(Saccharomyces pastorianus)FBY0095为研究对象,并与其诱变得到的优良超高浓(VHG)酿造酵母(S. pastorianus)L6对比,以阐明VHG酿造对酵母生理代谢的影响为目标,在充分了解酿酒酵母胞内碳源代谢途径、辅因子代谢过程和代谢环境的基础上,运用代谢工程和微生物生理学的理论和方法,在代谢水平对影响VHG酿造酵母发酵速率和生理活性的关键因素进行分析和调控。主要研究结果如下:(1)以酿酒酵母(S. pastorianus)FBY0095为初始菌株对其进行UV照射和甲基磺酸乙酯复合诱变,然后在含有高浓度麦芽糖和乙醇的培养基上进行驯化培养。突变菌株L3和L6在含有15%(w/v)麦芽糖和15%(w/v)乙醇培养基上表现较好的生长状态。突变株L3和L6的VHG发酵速率比初始菌株FBY0095显著提高,使发酵周期缩短了21.43%。VHG发酵结束时(28d),相对初始菌株FBY0095,突变株L3和L6的残糖较低,乙醇浓度较高,细胞活力较高,其生产的啤酒乙酸乙酯含量显著下降,风味明显改善。(2)以不同浓度的葡萄糖和麦芽糖为底物,模拟啤酒酿造过程(厌氧和低温发酵),研究了糖浓度对酿酒酵母(S. pastorianus)FBY0095和优良VHG酿酒酵母(S. pastorianus)L6发酵特性的影响。运用拟稳态方法定量分析了酵母胞内的代谢通量,并分析了酵母胞内糖酵解途径关键酶(己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶)活性及其对代谢流的定量调控作用。结果发现,随着糖浓度升高,酵母FBY0095糖酵解途径的代谢通量和关键酶活逐渐降低。在VHG条件下,酵母L6糖酵解途径的代谢通量和关键酶活均比酵母FBY0095的高。酵母胞内磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶对代谢通量控制作用较强,可认为这两种酶的催化反应是糖酵解流的关键调控步骤。(3)研究了不同浓度麦汁对酿酒酵母(S. pastorianus)FBY0095和优良VHG酿酒酵母(S. pastorianus)L6胞内辅因子(磷酸腺苷和辅酶I)代谢的影响,并且分析了辅因子对发酵速率的调控作用。随着麦汁浓度升高酵母FBY0095胞内ATP含量和能荷(EC)水平逐渐升高,对磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶起到抑制作用,从而导致糖利用速率降低。麦汁浓度升高导致酵母FBY0095胞内NADH/NAD~+值升高,使乙醇生成速率降低,胞内代谢流分布也发生了变化。另外,在VHG条件下,酵母L6胞内ATP含量、EC水平和NADH/NAD~+值比酵母FBY0095的低,因此酵母L6的代谢活性,糖利用速率和乙醇生成速率均比FBY0095高。(4)研究了不同浓度麦汁对酿酒酵母(S. pastorianus)FBY0095和优良VHG酿酒酵母(S. pastorianus)L6胞内代谢环境的影响,主要是分析了胞内H+动态变化过程,并阐述了乙醇压力对细胞膜的影响。随着麦汁浓度升高,酵母FBY0095细胞膜上H+-ATPase活性逐渐降低,胞内H+输出能力降低,从而导致胞内pH降低,胞内代谢环境酸化,不利于代谢反应进行,并且胞内外pH差异也相应降低,导致酵母细胞对底物的利用能力下降。当乙醇浓度达到4%(w/v)时酵母代谢活性受到显著的抑制。另外,相对酵母FBY0095,酵母L6的细胞膜不饱和度较高,使其耐乙醇性能升高,代谢环境得到改善。(5)研究了不同分子量大豆肽对酿酒酵母(S. pastorianus)FBY0095生长和耐乙醇性能的影响,结果发现大豆肽分子量小于1kDa时有利于酵母细胞生长,分子量为3～5kDa的大豆肽可提高酵母的耐乙醇性能。将0.2%大豆肽添加到含有12%(w/v)乙醇的YNB培养基中,发现大豆肽吸附于细胞表面,使细胞膜透性降低,细胞活性升高。添加大豆肽使酵母的耐乙醇和代谢相关基因(OLE1、ELO1、TPS1、PMA1和MAL1)的表达水平升高,特别是OLE1基因提高最显著。在VHG酿造过程中添加0.2%大豆肽(3kDa < Mw < 5kDa)使酵母发酵性能显著提高,并且使酵母细胞膜不饱和度增加,提高了细胞的耐乙醇性能,从而使H+-ATPase活性增加,改善胞内代谢环境。