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如何延长异体皮肤移植物存活时间是烧伤创面修复领域中的主要问题。而作为皮肤中抗原性最强的表皮组织是引发皮肤移植排斥反应的关键部位。表皮组织主要由角盶细胞、郎格罕细胞(Langerhans cells,LCs)和树突状表皮内T淋巴细胞(dentritic epidermal T lymohocytes,DETC)构成。传统观点认为LCs是引发异体皮肤移植免疫排斥反应的核心因素。但有观点认为LCs拥有免疫调节功能,而非普遍认为的强烈的免疫激活功能。通过LC敲除小鼠皮肤移植模型研究表明:与供受体都是野生型小鼠的皮肤移植相比,供体、受体以及供受体都缺乏LCs的小鼠之间的皮肤移植免疫排斥反应的发生时间并没有延长;说明单纯依靠LCs并不能直接引发皮肤移植免疫排斥反应。提示我们除LCs外,在皮肤移植免疫排斥反应中还可能存在其他的关键细胞参与。另外一种构成表皮组织免疫微环境的重要细胞是DETC,即γδT细胞。γδT细胞优先于αβT细胞出现,主要分布于小肠、肺、生殖器官及皮肤等黏膜及皮下组,抗原识别无MHC限制性,其受体缺乏多样性,只能识别共同抗原,γδT细胞识别抗原分子后,增殖分化为细胞毒性T细胞发挥生物学功能。γδT细胞被认为是机体免疫体系的“初级防线”。有研究表明DETC具有促进皮肤移植排斥反应的发生的作用。并且人类和小鼠外周血中的γδT细胞在激活后可同时表达高水平的共刺激分子如CD80/CD86等和MHCII类分子,并有效地处理并递呈多肽抗原直接激活na?ve CD4+T细胞,表现出专职抗原递呈细胞的特性。而我们实验室前期的研究则表明外周循环中的γδT细胞以及皮肤组织中的DETC在激活后自发性高表达IFN-γ而不表达TGF-β。又有文献表明异基因皮肤移植后供体DETC能够通过淋巴引流进入淋巴结,参与na?ve CD4+T细胞的激活分化过程。与αβT细胞不同,γδT细胞不需要专职抗原递呈细胞(APCs)辅助,该细胞就能够通过膜表面TCRγδ分子直接识别应激性抗原、磷酸化抗原以及热激蛋白的同源分子等多种形式的抗原,并被这些抗原激活而分泌大量的IL2、TNFa,IFNγ等免疫激活因子。以上信息提示我们DETC也具有类似LC的功能,可直接启动皮肤移植排斥反应。我们主要拟议通过MHC微小差异型皮肤移植模型及na?ve CD4+T细胞分化实验及抗体中和小鼠体内IFN-γ后皮肤移植模型来初步研究DETC在皮肤移植免疫排斥反应中的作用及机制。研究内容及方法1.建立同系MHC分子微小差异的不同性别C57 BL/6小鼠(雄-雌)之间的皮肤移植,比较野生型(WT)组与基因敲除(GK)组移植皮片存活时间。2.免疫荧光及流式细胞技术鉴定小鼠DETCs细胞表型、形态学特征及细胞表达情况。3.通过na?ve CD4+T细胞分化实验及DETCs和na?ve CD4+T细胞进行共培养,观察DETCs对淋巴细胞分化方向的影响。4.建立小鼠皮肤移植模型,比较γ干扰素中和(IN)组与同行对照(C)组和GK组移植皮片存活时间。5.通过Con A对新鲜分离小鼠表皮细胞刺激与否,比较刺激组与对照组DETC表达IFN-γ情况。实验结果1.基因敲除组小鼠移植皮片存活时间为22~35 d,较野生型组的12~16 d明显延长(χ2=14.1,P<0.01)。2.小鼠表皮细胞中DETCs阳性表达率为7.27%。且DETCs均为CD3+表型细胞,呈树突状散在分布在皮肤表皮中。3.DETCs体外与na?ve CD4+T细胞共培养可以诱导该型T细胞向Th1方向分化。4.IFN-γ中和组小鼠移植皮片存活时间为19~24d,较同型对照组的12~16 d明显延长(χ2=13.6,P<0.001),但与基因敲除组小鼠移植皮片存活时间无差异(χ2=0.06,P=0.81)。5.刺激组与对照组小鼠表皮细胞中DETC IFN-γ表达率分别为22.7%和0.51%。结论DETC在C57BL/6小鼠MHC分子微小差异的不同性别小鼠(雄-雌)之间的皮肤移植免疫排斥反应中起促进作用,该作用可能是通过细胞分泌IFN-γ实现。