【摘 要】
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目的:G-四链体是由富含鸟嘌呤单链核苷酸形成的特定二级结构。在金属离子存在的情况下,富含鸟嘌呤的单核苷酸形成以G-四平面为基本组成的G-四链体。目前已有多篇文章报道G-四链体与免疫细胞、免疫应答或免疫逃逸相关。另外G-四链体AS1411作为核仁素（NCL）的配体而被熟知,而NCL已经被报道参与多种抗病毒过程。为了进一步了解G-四链体AS411与免疫细胞调节之间的关系,本实验将对G四链体结构的建立判
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目的:G-四链体是由富含鸟嘌呤单链核苷酸形成的特定二级结构。在金属离子存在的情况下,富含鸟嘌呤的单核苷酸形成以G-四平面为基本组成的G-四链体。目前已有多篇文章报道G-四链体与免疫细胞、免疫应答或免疫逃逸相关。另外G-四链体AS1411作为核仁素（NCL）的配体而被熟知,而NCL已经被报道参与多种抗病毒过程。为了进一步了解G-四链体AS411与免疫细胞调节之间的关系,本实验将对G四链体结构的建立判断方式验证AS1411是否形成G-四链体、AS1411对T细胞的免疫特性的影响及T细胞肿瘤杀伤作用的影响,及其潜在机制进行探讨。研究方法:1、通过圆二色光谱（CD）,及热差异图谱（TDS）分析19条确定NMR结构的G-四链体结构,建立新方法分析G-四链体结构。2、体外,诱导增殖T细胞,采用MTT检测AS1411对CD8+T细胞的增殖影响:选出最佳作用剂量和最佳时间,完成后续的实验,并用流式细胞数（FCS）检测T细胞表面抗原表达情况、流式分选CD8+T细胞。体外,Western Blot法检测细胞中蛋白表达水平、ELISA检测T细胞分泌细胞因子水平等。3、采用最佳浓度和时间作用CD8+T细胞后作用宫颈癌细胞系Hela、克隆形成实验检测AS1411与CD8+T对宫颈癌细胞的增殖能力的影响;TUNEL检测宫颈癌细胞凋亡的情况;细胞划痕实验检测宫颈癌细胞迁移情况。结果:1、使用CD光谱互补TDS来研究19条G-四链体在不同离子环境中的结构特征。通过CD光谱将序列分为平行、反平行和混合三组。然后,反平行组可被TDS再分为椅式和篮式结构,从而与NMR结果对比,形成一种新的G-四链体结构研究方式。2、G-四链体AS1411对T细胞增殖的作用呈时间与剂量相关性;在AS1411作用后,CD8+CD28+T细胞比例明显增加;初始T细胞比例减少而终末效应T细胞比例增加;CD4+CD25+CD127-的Treg细胞比例在AS1411作用后明显减少;AS1411能够上调CD8+T细胞的TLR4,而下调FasL;经AS1411作用后CD8+T细胞分泌的促炎因子TNF-α、IL1-β、IL-6表达升高,抑炎因子IL-10表达下降;通过二代测序分析猜测出AS1411可能通过NF-kB途径正向调控CD8+T细胞;通过流式分析抑制剂、激活剂对NF-κB通路途径结果验证:结果显示,control序列、AS1411、NF-κB抑制剂+AS1411、NF-κB激活剂白桦脂酸以最适浓度作用后,AS1411与NF-κB激活剂对T细胞刺激后的结果一致。3、体外通过CD8+T与肿瘤细胞共培养及CD8+T培养上清培养肿瘤细胞的方法使用MTT法、划痕实验、细胞克隆实验、TUNEL凋亡检测等方式验证AS1411能够增强体外培养的免疫细胞CD8+T的抗肿瘤增殖作用。结论:1、TDS可以从所有反平行G-四链体中分辨反平行椅式结构。本研究可能为未来检测G-四链体提供一种简单易行的方法。2、AS1411可能通过NF-κB途径正向调控CD8+T细胞分泌TNF-α、IL1-β、IL-6及正向调控免疫效应细胞比例增加。3、体外通过CD8+T与肿瘤细胞共培养及CD8+T培养上清培养肿瘤细胞的方法证明了 AS1411+CD8+T对宫颈癌存在抑制增殖、迁移侵袭、促进凋亡的作用。
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