MicroRNAs(miRNAs)是一类重要的调控基因表达的大小约19-24个碱基的单链小分子非编码RNA，在进化上高度保守，它广泛存在于动物、植物、细菌、病毒等多种生物体内。研究揭示miRNAs与胚胎的发育、干细胞分化、细胞凋亡、以及不同种类肿瘤的发生、发展相关，此外miRNAs还可以通过调控宿主的基因表达来调控病原的感染。miRNAs经RNA诱导的基因沉默复合体(RISC)作用降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因的翻译从而达到调控作用。在线虫、果蝇、小鼠和人等物种已经发现的miRNAs功能研究中发现miRNA的表达水平在不同组织、不同生长发育阶段存在显著差异，这一特征和其他参与调控基因表达的分子相同，同时也提示miRNA有可能参与基因表达的调控。　　 迄今为止，蚊子，昆虫中有关miRNAs的鉴定报道有限，蚊子和昆虫通常做为传播许多人类病原体的必要载体。2003年，Wang等在冈比亚按蚊中通过生物信息学的方法发现了与果蝇miRNA序列相近的38种miRNAs。2007年底，Christine Brunel等采用小RNA克隆结合生物信息学分析方法鉴定了18种冈比亚按蚊的miRNAs，并分析了冈比亚按蚊在不同生长发育阶段miRNA表达谱的差异。Knock down冈比亚按蚊Dicerl和Agol mRNA后（冈比亚按蚊的miRNA合成受阻），结果显示冈比亚按蚊对疟原虫的易感性增加了。2008年Mead等采用小RNA克隆和生物信息学方法在斯氏按蚊中鉴定出27种miRNAs，并揭示miRNA可能有调节蚊生长发育和疾病传播过程的作用。2010年scalsky等分析鉴定了致倦库蚊成蚊和白纹伊蚊C7/10细胞的miRNAs，发现miRNAs的表达在感染西尼罗病毒(WNV)后存在差异，提示miRNAs可能有调控病毒感染的作用。　　 嗜人按蚊是我国特有的蚊种，也是中国疟疾的重要传播媒介。但是目前有关嗜人按蚊miRNAs的研究尚未见报道。本研究通过illumina Hiseq2000高通量测序和生物信息学分析方法，首次对嗜人按蚊miRNAs的表达谱进行系统性分析，丰富了蚊miRNA并揭示一些新的蚊特异miRNAs。并用Northern blot鉴定了部分miRNAs在嗜人按蚊不同生长发育阶段的差异表达，为进一步研究差异表达的miRNAs在调控蚊生长发育及其与病原体之间的作用机制研究提供了基础。　　 目的：　　 1.通过illumina Hiseq2000高通量小RNA测序，生物信息学分析方法，分析嗜人按蚊miRNAs的表达谱，丰富对蚊miRNAs了解。　　 2.Northernblot鉴定miRNAs在嗜人按蚊不同生长发育阶段的表达差异，为进一步研究miRNA在蚊子不同生长发育过程中的调控机制提供依据。　　 方法：　　 1.illumina Hiseq2000高通量小RNA测序及生物信息学分析嗜人按蚊miRNAs表达谱。　　 1.1 样品收集:成蚊为羽化后48h的嗜人按蚊成蚊。收集时4℃短暂冷冻分雌雄后分别收集。样本收集后液氮快速冷冻后置于-80℃储存。　　 1.2 RNA提取和鉴定:mirVanaTM miRNA Isolation Kit提取各样本的总RNA，核酸蛋白分析仪检测浓度及纯度，并用15％聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所提总RNA的质量。　　 1.3 小RNA测序:采用illumina Hiseq2000测序平台的单端50bp测序模式对嗜人按蚊的雌雄成蚊进行小RNA高通量测序。　　 1.4 原始数据的处理:原始数据需经过引物与adaptor序列去除，并经过对测序片段碱基的质量检验和长度筛选，最终选择质量可靠的测序片段。同时选择长度大于15bp，小于32bp的read(clean data)保留下来用于后续分析。　　 1.5 小RNA序列(clean data)的比对分析:将上述clean data序列与冈比亚按蚊和埃及伊蚊的基因组序列、外显子、内含子比对，并与miRNA数据库(miRBasel9.0)中所有miRNA前体(hairpin)、所有物种已知的成熟miRNA比对，并选取Rfam(10.1)数据库来注释测序得到的小RNA序列，尽可能的发现并去除其中可能的rRNA，scRNA，snoRNA，snRNA，tRNA1.6 miRNA表达量计算:非编码miRNA表达量计算是将与参考基因组序列匹配的clean reads(来自clean data)采用cufflink软件，并通过统计学方法计算每条miRNA表达量。miRNA表达量计算采用FPKM计算度量指标(FPKM-Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped),计算miRNA(hairpin)区间内miRNA表达量。FPKM含义是:以每百万比配序列每1Kbp长度做RNA表达量指标，其中转录本长度和总比配read数目用于归一化计算样本的表达量数值。　　 1.7 miRNA差异表达分析:对两组之间的表达谱进行差异分析。　　 1.8 新miRNA预测:采用miRDeep预测方法预测识别新miRNA，并采用RNA-fold预测分析miRNA结构。　　 2.Northern杂交验证嗜人按蚊miRNAs在不同发育阶段的的表达情况。　　 结果：　　 1.嗜人按蚊雌雄成蚊的小RNA测序结果以及生物信息学分析结果表明，共有151种已知的蚊miRNAs在嗜人按蚊雌雄成蚊中表达，雌雄成蚊的miRNAs表达有性别差异，如mir-989在雌蚊中高表达，而在雄蚊中几乎不表达。　　 2.Northern blot鉴定嗜人按蚊miRNAs在不同发育阶段的表达，结果提示miRNAs存在期特异性表达，如miR-2943只在嗜人按蚊卵表达，而在其幼虫、蛹及成蚊期几乎不表达，推测miRNA-2943可能跟蚊卵的发育有关。　　 结论：　　 1.用高通量小RNA测序结合生物信息学分析得到了嗜人按蚊miRNAs的表达谱，发现部分miRNAs在雌雄成蚊中的表达量有明显差异。　　 2.Northern杂交验证结果表明部分嗜人按蚊miRNAs表达具期特异性，可能在嗜人按蚊的发育、吸血生理过程中起调控作用。